ICS 65.020.01 NY B 05 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2871—2015 水稻中43种植物激素的测定 液相色谱一串联质谱法 Determination of 43 plant hormones in rice-Liquid chromatography-Tandemmass spectrometry 行业标准信息服务平台 2015-12-29发布 2016-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2871—2015 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部稻米及制品质量监督检验测试中心、中国水稻研究所。 本标准主要起草人：曹赵云、陈铭学、牟仁祥、张卫星、章林平、朱智伟。 行业标准信息服务平台 I NY/T2871—2015 水稻中43种植物激素的测定 液相色谱一串联质谱法 1范围 本标准规定了水稻中43种植物激素（见附录A）的液相色谱一串联质谱测定方法。 本标准适用于水稻植株的根、茎、叶等组织中43种植物激素含量的测定。 本标准的方法检出限为0.02ng/g~8.0ng/g。 2 规范性引用文件 下列文件对于 文件 新版本（包括所有的修 Q GB/T668 各和试验方牌 术语和定 下列术语和定义 于本文件 3.1 植物激素 plant hormone 由植物自 身仓成 通常自产 生部位移动到作用部位并在极低浓度下具 理作用的微量有机 物质，也被称为 植物 激系或植物内源激 4 原理 试样用甲 浴液 交换固 相萃取柱# 全稀释后用混合 相色谱一串联质谱测 提取液绘 定，根据色谱保 外标法定 5 试剂和材料 以下所用试 利 一级水。 5. 1 甲醇（CH.OH） 谱纯 5.2 乙醇CH,OH) 色谱纯。 5.3 甲酸（HCOOH）：色 5.4 二甲基亚（C,H.OS)： 5.5 务平台 5.6 甲醇+水（80+20）：取80mL甲醇（5.1）加20mL水，混匀。 5.7 甲醇+水（60+40）：取60mL甲醇（5.1）加40mL水，混勺。 5.8 乙醇+水（80+20）：取80mL乙醇（5.2）加20mL水，混勺。 5.9 1%甲酸溶液：准确吸取1.00mL甲酸（5.3）加水至100mL。 5.10 1%甲酸甲醇溶液：准确吸取1.00mL甲酸（5.3）加甲醇（5.1）至100mL。 5.11 1mol/L氢氧化钠溶液：称取4.0g氢氧化钠（NaOH)加水溶解至100mL 5. 12 0.1mol/L氢氧化钠甲醇溶液：称取0.4g氢氧化钠（NaOH)加甲醇（5.1)溶解至100mL。 5. 13 0.5%氨水甲醇溶液：准确吸取0.50mL氨水（NHOH）加甲醇（5.1）至100mL。 1 NY/T2871—2015 5.145mmol/L甲酸铵：称取0.315g甲酸铵（HCO,NH）加水溶解至1000mL。 5.1543种植物激素标准品：纯度≥98%，见附录A。 5.16植物激素标准溶液配制 5.16.1标准储备液：分别称取各植物激素标准品（精确至0.1mg）至棕色容量瓶中，根据标准物的溶 解性选甲醇、乙醇等溶剂（见附录A）配成浓度为1000uμg/mL的标准储备溶液，于一80℃保存。 5.16.2混合标准储备液：分别吸取一定量的43种植物激素标准储备液（5.16.1），置于棕色容量瓶中， 用甲醇稀释成浓度为1.00μg/mL的混合标准储备液，于一80℃保存。 5.16.3混合标准工作溶液：分别吸取一定量的混合标准储备液（5.16.2），用甲醇十水（20十80）稀释成 浓度为0.02ng/mL~100ng/mL的植物激素混合标准工作溶液，临用新配。 5.17混合型阴离子交换固相萃取柱：60mg，3mL；或其他等效柱。使用前依次用2mL甲醇和2mL 水活化。 5.18混合型阳离子交换固相萃取柱：60mg，3mL,或其他等效柱。使用前依次用2mL甲醇和2mL 1%甲酸溶液（5.9）活化。 5.19液氮。 5.20滤膜：0.22μm，有机相。 6仪器 6.1液相色谱一串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI。 6.2分析天平：感量土0.0001g。 6.3漩涡混合器。 6.4冷冻离心机：最高转速大于或等于5000r/min。 6.5氮吹仪。 6.6超低温冰箱：温度可至一80℃。 7试样制备 取新鲜的水稻植株，如根、茎、叶等供试样，用水洗净样品附着的杂物，表面水分用吸水纸擦干，剪 碎，于研钵中加液氮磨细，混匀.立即转移至一80℃冰箱中避光保存。 8分析步骤 8.1提取 称取约0.2g试样（精确到0.1mg）于15mL塑料离心管中，加人2mL预冷（4℃）的甲醇十水（80+ 20），置于4℃冰箱中浸提16h，其间振摇2次~3次；取出，于4℃下5000r/min离心10min.倾出上清 液；往残渣中再次加人2mL甲醇十水（80+20）.漩涡振荡，按上述条件离心，合并2次提取液于10mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，混匀，待净化。 8.2净化 8.2.1A组植物激素（见附录A)的净化：移取4.00mL上述提取液过混合型阴离子交换固相萃取柱 （5.17），依次用2mL水和2mL甲醇淋洗，用2mL1%甲酸甲醇溶液（5.10）洗脱2次，洗脱液用5ml 刻度管收集，并于50℃下氮吹至近干，加水稀释至0.5mL，漩涡混匀，滤膜过滤，该溶液用于A组植物 激素的测定。 8.2.2B组植物激素（见附录A）的净化：吸取4.00mL上述剩余提取液于15mL离心管中，加入40 μL甲酸（5.3），混匀后转移至混合型阳离子交换固相萃取柱（5.18）中，用1mL甲醇十水（20十80）冲洗 2 NY/T2871—2015 离心管后过柱，并重复1次，依次用2mL1%甲酸溶液（5.9）和2mL甲醇淋洗，用2mL0.5%氨水甲醇 匀，滤膜过滤，该溶液用于B组植物激素的测定。 8.3液相色谱一串联质谱测定 8.4色谱参考条件 a）色谱柱：ZORBAXExtend-C18（1.8μm，100mmX2.1mm），或相当者； b）流动相及梯度洗脱条件见表1； 表1流动相及梯度洗脱参考条件 时间 流动相A（5mmol/L甲酸铵） 流动相B(甲醇) 流速 min % % mL/min 0.0 90 10 0.15 30.0 55 45 0.15 35.0 5 95 0.15 35.1 90 10 0.15 55.0 90 10 0.15 c) 柱温：40℃； d) 进样量：5μL。 8.5 质谱参考条件 a) 离子源：ESI源； b) 扫描方式：正离子扫描模式和负离子扫描模式（参见附录B）： c) 喷雾电压：2.8kV，-2.2kV； d) 离子源温度：350℃； e) 检测方式：多反应监测； 鞘气压力（氮气）：241kPa； g) 辅助气流量（氮气）：1.5mL/min； h) 碰撞气（氩气）压力：0.2Pa； i) 离子传输管温度：300℃； j) 监测离子对、碰撞能量和透镜电压等质谱参数参见附录B。 8.6定性测定 在进行样品测定时，若检出物质保留时间与标准溶液保留时间的偏差不超过标准溶液保留时间的 土2.5%，且所选择的离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，即相对丰度>50%，允许士20%偏 差；相对丰度>20%~50%，允许士25%偏差；相对丰度>10%~20%，允许±30%偏差；相对丰度 10%，允许士50%偏差，则可判定样品中存在该植物激素。 8.7定量测定 取混合标准工作液与试样交替进样，采用单点或多点校准，外标法定量。当样品的上机液浓度超过 线性范围时，需根据测定浓度，稀释后进行重新测定。43种植物激素标准溶液的多反应监测色谱图参 见附录C。 9 结果计算 样品中植物激素含量按式（1）计算。 (1) mXV2 式中： 3 NY/T2871—2015 样品中植物激素含量，单位为纳克每克（ng/g）； 提取液定容体积，单位为毫升（mL）； 样液中植物激素质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Vi 一样液最终定容体积，单位为毫升（mL）； 试样的质量，单位为克（g）； m V2 用于净化的提取液体积，单位为毫升（mL）。 平行测定结果用算术平均值表示，结果保留两位有效数字 10 精密度 在重复性条件下获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的20%。 服务平台 NY/T2871—2015 附录A （规范性附录） 43种植物激素中英文名称（缩写）、溶剂选择、CAS号、方法检出限和分组 43种植物激素中英文名称（缩写）溶 号、方法检出限和分组见表A.1。 表A.143种植物激素中英文名称（缩写）、溶剂选择、CAS号、方法检出限和分组 序 检出限 中文名称 AS号 溶剂 号 ng/g 赤霉素A bberell 97 甲醇 0.8 2 赤霉素A Ac dCGA 甲醇 0.8 3 赤霉素 ibberellinA（GA） 甲醇 3.0 4 赤霉素 甲醇 2.0 5 赤霉 醇 0.1 6 赤霉 醇 0.2 7 赤霍 0.3 80 赤翟 0.3 9 赤 1912 0.8 10 赤 19427 1. 5 11 赤 36434 1.5 12 赤 0.3 13 脱 cid(ABA) 0.2 14 脱落 1.5 15 茉莉 醇 8.0 16 水杨酸 甲醇 5.0 17 吲哚-3 acidclA 甲醇 2.0 18 吲哚-3 D 137 cid(IBA 甲醇 0.8 19 N-（吲哚- 甲醇 1.5 N-(羟吲哚-3 L-苯内 phenylalanine 20 50-7 乙醇 0.2 酸 N-