ICS 65.100 B92 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2873—2015 农药内分泌干扰作用评价方法 Evaluation method of pesticide endocrine disrupting effects 行业标准信息服务平台 2015-12-29发布 2016-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2873—2015 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：农业部农药检定所、国家食品安全风险评估中心。 本标准主要起草人：陶传江、李宁、宋雁、陶岭梅、张丽英、李敏、刘然、孟宇晰、闫艺舟、张文众、谭彦 君、刘兆平、贾旭东、毛伟峰、方瑾、叶纪明 行业标准信息服务平台 I NY/T2873—2015 农药内分泌干扰作用评价方法 1范围 本标准规定了内分泌干扰作用的基本试验方法和技术要求。 本标准适用于评价农药的内分泌干扰作用 2规范性引用文件 下列文件对于本 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版 GB 5749 活饮 GB14922 验动物 GB1492 物学等级与监测 GB14923 哺乳类 实验动物 的遗传质量升制 GB 14 Co验 动物配合饲料通用 质量标准 2 GB 实 动物配合饲料卫生标准 192 GB 499 验动物 配合饲料营养成分 GB 境及设施 3术语和定 下列术请 3.1 农药 ticids pes 江 用于预防 林业的病虫 的地调节植物、昆虫 生长的化学合成或 也天然物质 一种物质或者种物 质的混 合物及其制剂。 3.2 受试物 test substance 被测试的单 学品或混合牛 3.3 内分泌干扰物 endocrinedisrupter 可改变生物或其后代、或（亚）群体内分泌系统功能 引不良健康效应的外源性物质。 4试验目的和程序 本方法用于检测和评价农药是否具有内分泌干扰作用，包括一阶段体外和体内试验、二阶段体内验 证试验。一阶段体外试验包括雌激素受体转录激活试验（用于筛选类雌激素活性物质）和体外类固醇合 成试验（用于筛查干扰类固醇合成的物质等）。一阶段体内试验包括子宫增重试验（用于筛选类雌激素 或抗雌激素活性作用的物质）、Hershberger试验（用于筛选类雄激素或抗雄激素效应以及抗甲状腺激 素作用物质）、青春期雌性大鼠试验（可用于筛选类雌激素、抗雌激素或抗甲状腺激素作用的物质）和青 春期雄性大鼠试验（可用于筛选类雄激素、抗雄激素或抗甲状腺激素作用的物质）。对于适合一阶段体 外方法的受试物，首先经过一阶段体外试验筛选后进人一阶段体内试验，不适合进行一阶段体外筛选的 受试物则直接采用一阶段体内试验进行筛选。如一阶段体内试验筛选显示阳性结果，则需对受试物进 1 NY/T2873—2015 一步开展二阶段体内验证试验。二阶段体内验证试验是通过一代生殖毒性扩展试验，验证具有（抗）雌 激素、（抗）雄激素和抗甲状腺激素的物质，明确受试物对内分泌系统的潜在危害及靶点 5试验方法 5.1一阶段体外试验 5.1.1雌激素受体转录激活试验 5.1.1.1原理 本试验是利用报告基因技术，以细胞为模型来检测雌激素受体和配体的结合能力。受体与配体结 合后，受体一配体螯合物转移至细胞核，与特定的DNA响应元件结合，并转录激活一个荧光素酶报告 基因，引起荧光素酶表达增加。荧光素是一种酶作用底物，在荧光素酶的作用下，可被转化为一种生物 荧光产物，利用光度计或酶标仪可对其进行定量测定。 5.1.1.2试验步骤 5.1.1.2.1细胞株 采用稳定转染人类雌激素α受体基因的hERα-Hela细胞株，试验正式开始前应对该细胞株的有 效性进行判定。 5.1.1.2.2细胞培养 采用无酚红的Eagle'sMinimumEssentialMedium（EMEM），加人60mg/L的卡那霉素，1o%胎牛 血清（胎牛血清经右旋糖苷包裹的木炭处理去除雌激素活性物质，dextran-coated-charcoal-treatedfetal bovineserumDCC-FBS），将细胞置于细胞培养箱培养[5%COz，（37士1）℃]。当细胞覆盖率达到 75%~90%时，可进行传代培养，一般在100mm细胞培养血中加10mL细胞液，每毫升细胞液中有 0.4X105~1X105个细胞。用10%FBS-EMEM（或加有DCC-FBS的EMEM）将细胞悬浮，然后将 人5%CO培养箱中（37士1）℃培养3h，然后开始细胞染毒。试验所用塑料器皿不能被雌激素活性物 质污染。 为了保持试验的完整性，试验所用细胞复苏后应至少经传代培养一次，传代次数不超过40代。 5.1.1.2.3质量控制要求 5.1.1.2.3.1试验体系灵敏度的验证 在试验开始前和试验过程中，应采用适当浓度的阳性和阴性参比物对试验体系的灵敏度进行验证。 阳性参比物包括具有不同强度雌激素效应的物质[17β-雌二醇（17β-estradiolE2）.CAS号50-28-2； 17α-雌二醇，CAS号57-91-0；17α-甲基睾酮CAS号58-18-4J；阴性参比物为肾上腺酮（CAS号 99-45-6）。浓度设定如表1所示。 表1试验体系灵敏度的验证中阳性和阴性参比物浓度 项目 17β-雌二醇 17α-雌二醇 17α-甲基睾酮 肾上腺酮 浓度1 10nmol/L 1 μmol/L 10 μmol/L 100μmol/L 浓度2 1 nmol/L 100nmol/L 1 μmol/L 10 μmol/L 浓度3 100pmol/L 10nmol/L 100nmol/L 1 μmol/1. 浓度4 10pmol/L 1 nmol/ L 10nmol/L 100mmol/L 浓度5 1 pmol/ L 100pmol/L 1 nmol/L 10nmol/L 浓度6 0.1pmol/L 10pmol/L 100pmol/L 1 nmol/L 浓度7 0.01pmol/L 1pmol/L 10pmol/L 100pmol/L 5.1.1.2.3.2溶媒和阳性对照 应将受试物溶解于适当的溶媒中，溶媒应能增加受试物的溶解度，且易与细胞培养液混合，水、乙醇 2 NY/T2873—2015 一步开展二阶段体内验证试验。二阶段体内验证试验是通过一代生殖毒性扩展试验，验证具有（抗）雌 激素、（抗）雄激素和抗甲状腺激素的物质，明确受试物对内分泌系统的潜在危害及靶点 5试验方法 5.1一阶段体外试验 5.1.1雌激素受体转录激活试验 5.1.1.1原理 本试验是利用报告基因技术，以细胞为模型来检测雌激素受体和配体的结合能力。受体与配体结 合后，受体一配体螯合物转移至细胞核，与特定的DNA响应元件结合，并转录激活一个荧光素酶报告 基因，引起荧光素酶表达增加。荧光素是一种酶作用底物，在荧光素酶的作用下，可被转化为一种生物 荧光产物，利用光度计或酶标仪可对其进行定量测定。 5.1.1.2试验步骤 5.1.1.2.1细胞株 采用稳定转染人类雌激素α受体基因的hERα-Hela细胞株，试验正式开始前应对该细胞株的有 效性进行判定。 5.1.1.2.2细胞培养 采用无酚红的Eagle'sMinimumEssentialMedium（EMEM），加人60mg/L的卡那霉素，1o%胎牛 血清（胎牛血清经右旋糖苷包裹的木炭处理去除雌激素活性物质，dextran-coated-charcoal-treatedfetal bovineserumDCC-FBS），将细胞置于细胞培养箱培养[5%COz，（37士1）℃]。当细胞覆盖率达到 75%~90%时，可进行传代培养，一般在100mm细胞培养血中加10mL细胞液，每毫升细胞液中有 0.4X105~1X105个细胞。用10%FBS-EMEM（或加有DCC-FBS的EMEM）将细胞悬浮，然后将 人5%CO培养箱中（37士1）℃培养3h，然后开始细胞染毒。试验所用塑料器皿不能被雌激素活性物 质污染。 为了保持试验的完整性，试验所用细胞复苏后应至少经传代培养一次，传代次数不超过40代。 5.1.1.2.3质量控制要求 5.1.1.2.3.1试验体系灵敏度的验证 在试验开始前和试验过程中，应采用适当浓度的阳性和阴性参比物对试验体系的灵敏度进行验证。 阳性参比物包括具有不同强度雌激素效应的物质[17β-雌二醇（17β-estradiolE2）.CAS号50-28-2； 17α-雌二醇，CAS号57-91-0；17α-甲基睾酮CAS号58-18-4J；阴性参比物为肾上腺酮（CAS号 99-45-6）。浓度设定如表1所示。 表1试验体系灵敏度的验证中阳性和阴性参比物浓度 项目 17β-雌二醇 17α-雌二醇 17α-甲基睾酮 肾上腺酮 浓度1 10nmol/L 1 μmol/L 10 μmol/L 100μmol/L 浓度2 1 nmol/L 100nmol/L 1 μmol/L 10 μmol/L 浓度3 100pmol/L 10nmol/L 100nmol/L 1 μmol/1. 浓度4 10pmol/L 1 nmol/ L 10nmol/L 100mmol/L 浓度5 1 pmol/ L 100pmol/L 1 nmol/L 10nmol/L 浓度6 0.1pmol/L 10pmol/L 100pmol/L 1 nmol/L 浓度7 0.01pmol/L 1pmol/L 10pmol/L 100pmol/L 5.1.1.2.3.2溶媒和阳性对照 应将受试物溶解于适当的溶媒中，溶媒应能增加