NY ICS65.100.30 B 17 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2889.1—2016 氨基寡糖素 第1部分：氨基寡糖素母药 Oligochitosan- Part1:Oligochitosan technicalconcentrates(TK) 行业标准信息服务平台 2016-05-23发布 2016-10-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2889.1—2016 前言 NY/T2889《氨基寡糖素》分为2部分： 第1部分：氨基寡糖素母药； 第2部分：氨基寡糖素水剂。 本部分为NY/T2889的第1部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由农业部种植业管理司提出并归口。 本部分起草单位：农业部农药检定所、中国科学院大连化学物理研究所。 本部分主要起草人：周欣欣、袁善奎、杜昱光、李曙光、李国平、翟唯钢、曲、张善学、拓亚琴、周艳 明、王一喆。 行业标准信息服务平台 I NY/T2889.1—2016 氨基寡糖素 第1部分：氨基寡糖素母药 1范围 本部分规定了农药氨基寡糖素母药的要求、试验方法、标志， 标签、包装、贮运及验收。 本部分适用于以壳聚糖为原料、采用生化技术生产 的氨基寡糖素母药。 2 规范性引用文件 RD 下列文件对 不可少的， 凡是注日 仅注 日期的版本适用于本文 用本 件。凡是不注日 版本（包括所有的修 GB/T 19 农发PH值的测定方法 GB/T 601 GB/T 1604 商品 药验收规则 GB/T 160 商品 农药采样方法 GB 3 农苹包 796 装通则 GB 5 1009 安全国家 标准食品中水分的测定 食品中灰分的测定 国家标准 GB/ GB/ 70 20 数值修约规则与极限数值的 示和判定 GB/ T 136 201 约水不溶物 勿测定方 3 要求 3.1 外观 本品外观为浅货 3.2指标 氨基寡糖素母药质量控制项目 要求 表 氨享糖素药控制项目及指 项 指 标 氨基寡糖素质量分数，% 80.0±2.5 氨基葡萄糖质量分数，% <0.5 灰分，% ≤2.0 水分，% pH 3.0~6.0 水不溶物，% 0.5 4 试验方法 4.1 抽样 按照GB/T1605规定进行样品的采集，用随机数表法确定抽样的包装件，最终抽样量不少于 100g。采样时应特别注意避免样品污染，采样容器和工具应经过消毒灭菌，样品采集后应立即进行检 验，若不能立即检验，应在4℃条件下贮存。 1 NY/T2889.1—2016 4.2 鉴别试验 根据实验室的条件可选择离子色谱法或质谱法进行氨基寡糖素有效成分的鉴别。 4.2.1离子色谱法 本鉴别试验可与氨基寡糖素母药中氨基葡萄糖质量分数的测定同时进行。在相同色谱条件下，氨 基寡糖素母药试样溶液中氨基葡萄糖、壳二糖、壳三糖、壳四糖、壳五糖和壳六糖色谱峰的保留时间与对 应标样溶液色谱峰的保留时间，其相对差值应在1.5%以内。氨基寡糖素母药至少要含有壳二糖至壳 六糖中的2个或者多个。氨基寡糖素母药和混合标准溶液的离子色谱见图1。 A 说明： A- 混合标准溶液： 壳四糖； 氨基寡糖素母药溶液； B 氨基葡萄糖： 壳六糖： 一壳三糖； 壳五糖； 壳二糖。 2- 图1 氨基寡糖素母药和混合标准溶液离子色谱图 4.2.2质谱法 4.2.2.1方法提要 本鉴别试验，通过样品的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS)分析，利用数 据处理软件，进行样品数均分子量、重均分子量、多分散性和平均聚合度统计分析，氨基寡糖素母药应至 少含有壳二糖至壳六糖中的2个或者多个。氨基寡糖素母药的质谱图见图2。 行业标准信息服务 5000 4000 523.9 3000 2.000 1000 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2.000 220 质荷比 说明： 壳二糖； 壳六糖； 5- 壳三糖： 壳七糖； 2 壳四糖； 壳八糖。 壳五糖； 图2氨基寡糖素母药质谱图 2 NY/T 2889.1—2016 4.2.2.2试剂和溶液 a）基质2,5-二羟基苯甲酸； b） 校正用混合多肽标准品； c) 乙腈：色谱纯； d）乙醇：色谱纯； e）三氟乙酸。 4.2.2.3仪器 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪，采用反射模式、正离子检测，全景式宽域聚焦技术，数据采 用统计软件进行分析处理。 4.2.2.4测定步骤 100：3配制成乙睛酸性溶剂。将2.5-二羟基苯甲酸和待测样品分别溶于上述溶剂配制成50g/L和 10g/L溶液备用。将等体积的基质和样品溶液充分混勾，取0.5L混合液滴于靶板上，待溶剂自然挥 发样品结晶后，滴加0.5乙醇，使样品与基质混合物二次结晶，乙醇挥发后即可进行质谱检测。 4.3氨基寡糖素质量分数的测定 氨基寡糖素质量分数的测定可以采用分光光度法和离子色谱法，其中离子色谱法作为仲裁方法。 4.3.1分光光度法 试样用浓盐酸（优级纯）水解成氨基葡萄糖，氨基葡萄糖在碱性条件下与乙酰丙酮形成色原，色原在 酸性反应液中与对二甲基氨基苯甲醛反应显红色，其颜色深浅程度与氨基寡糖素质量分数呈线性关系， 采用分光光度法测定氨基寡糖素的含量。 4.3.1.1试剂和溶液 a）水：去离子水； 125.45g/L磷酸三钠溶液（A溶液）：称取NaPO：12HzO125.45g，用水定容至1000mL； 100g/L四硼酸钠溶液（B溶液）：称取95%四硼酸钠100.00g，用水定容至1000mL； 磷酸三钠-四硼酸钠溶液：取98mLA与2mLB相混即得； e） 3.5%乙酰丙酮试剂：取乙酰丙酮3.5mL，用磷酸三钠-四硼酸钠溶液配成100mL； D 对二甲氨基苯甲醛（PDABA)试液：取0.16gPDABA溶于1.5mL12mol/L盐酸溶液后，以 10.5mL异丙内醇稀释 g）标样：盐酸氨基葡萄糖，已知质量分数≥99.0%。 4.3.1.2主要仪器、设备 分光光度计。 4.3.1.3试验步骤 4.3.1.3.1标样溶液的制备 准确称取标样0.6000g（精确至0.0002g），转移到25ml容量瓶中，用水定容至25mL，制成20 mg/mL氨基葡萄糖溶液。 用移液枪分别取20mg/mL氨基葡萄糖溶液375μL（相当于氨基葡萄糖7.5mg）置于10mL带聚 四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃管（水解管）中，然后用移液枪加人6mol/L盐酸2.625mL，充分混勾后在 管子里充入高纯氮气并将管子密封，于100℃油浴中加热3h。冷却到室温后打开螺旋盖，用移液枪将 1.0mL水解液转移到蒸发皿中，在70℃烘箱中挥发至干。加1mL水将蒸发皿中的固体溶解后在 70℃烘箱中挥发至干，此步骤重复2次。用5mL水将得到的固体溶解，并转移到25mL容量瓶中。用 5mL水洗涤蒸发皿，液体转人到同一容量瓶中，重复洗涤2次，用水定容到25mL。得到标准氨基葡萄 糖溶液。 3 NY/T2889.1—2016 4.3.1.3.2标准曲线的制作 取10mL带螺旋盖试管5支，依次加人氨基葡萄糖标准液0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL， 再分别用移液枪加水到总体积为0.8mL，得到浓度分别为0ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、75μg/mL 100ug/mL的氨基葡萄糖梯度溶液。在每个试管中加入乙酰丙酮试剂0.6mL.混匀，加盖，于100℃油 浴中加热30min，冰水浴冷却，冷至室温后加入2mLPDABA试剂。10min后以0ug/mL为对照，在 535nm处测定吸光度。做3组重复，取平均值。以吸光度为纵坐标、对应的氨基葡萄糖含量为横坐标 绘图。 4.3.1.3.3试样溶液的制备 称取30mg试样置于带四氟乙烯衬垫螺旋盖的玻璃管（水解管） .然后用移液管加人6mol/L盐 100℃油浴中加热3h。每个试样3个重 烘箱中挥发至干。加1 mL水将蒸发血中的固体溶解后 用 5mL水将得到的固体 溶解，并转移到50ml 容量瓶 水洗涤蒸麦皿，液体 量瓶中 重复洗涤2次.用 水定容。制得试样溶液 4.3.1.3.4测定 液加 取0.8mL试 样溶 10mL带螺旋盖试管中加入 艺酰丙酮 L混匀，加盖，于 minCa 100℃油浴中加热30 C浴冷却.冷至空温后加人2mL/PDABA试剂 音以 0ug/mL为 对照，在535nm 处测定吸光 从标准曲线中查到对应的氨基葡萄糖质量分 4.3.1.4计算方法 A 试样中氨基寡糖质 量分数W.按式（1）计算 50×100 U W X3X mX 式中： K 交正 系数K 生曲线 克每毫升 3 稀 50 稀释后记 为毫升 (mL) 试样取 m （mg 100 换算成百 1000 毫克换算成 4.3.1.5允许差 于5%，取其算术平均值作为测定 两次平行测定结果相对差，应不大 4.3.2离子色谱法（仲裁分析） 将氨基寡糖素母药在酸性条件下水解为氨基葡萄糖，以氢氧化钠溶液为流动相，使用脉冲安培检测 4.3.2.1试剂和溶液 a) 氢氧化钠溶液质量分数为50%：优级纯； 无水乙酸钠：优级纯； c) 水：符合GB/T6682中一级水的规定，即电导率（25℃）≤0.01mS/m d) 氢氧化钠溶液（8mol/L)； e) 盐酸溶液（8mol/L）； D 100mmol/LNaOH+100mmol/LCH.COONa溶液：在2L塑料试剂瓶中加人约1900mL经 4 NY/T2889.1—2016 过0.4um尼龙滤膜过滤的水，加入无水乙酸钠16.4g，再移入氢氧化钠溶