ICS 65.020 B 15 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2916—2016 棉铃虫抗药性监测技术规程 Code of practice of insecticide resistance monitoring of Helicoverpa armigera(Hubner) 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2916—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业部种植业管理司提出并归口。 本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、南京农业大学、江苏省植物保护站、山东省植物保护 总站。 本标准主要起草人：张帅、吴益东、张浩男、杨亦桦、武淑文、瀚国钢、宋姝娥。 行业标准信息服务平台 I NY/T2916—2016 棉铃虫抗药性监测技术规程 1范围 本标准规定了棉铃虫[Helicoverpaarmigera（Hubner）抗药性监测的基本方法。 本标准适用于棉铃虫对常用杀虫药剂及苏云金芽孢杆菌[Bacillusthuringiensis]杀虫晶体蛋白 CrylAc的抗性监测。 2术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2. 1 浸叶接虫法leaf-dippingbioassay 将浸过药液并晾干的常规棉花叶片放在底部平铺琼脂凝胶的24孔培养板内，使棉铃虫2龄初幼虫 接触和取食带药叶片的生物测定方法。 2. 2 毒素涂表法surfacecontaminationbioassay 将经磷酸缓冲液溶解的Cry1Ac蛋白均匀涂布到底部平铺棉铃虫人工饲料的24孔培养板表面，使 棉铃虫2龄初幼虫取食饲料表面杀虫蛋白的生物测定方法。 3仪器设备 3.1电子天平（感量0.1mg）。 3.2打孔器（直径与24孔组织培养板孔径相同）。 3.3诱虫灯。 3.424孔培养板（内径15.6mm）。 3.5微波炉。 3.6电磁炉。 3.7 移液器（5mL、1mL）。 3.8连续分液器（5mL)。 3.9量筒（500mL）。 3. 10 烧杯（10mL、25mL、100mL、500mL）。 4试剂与材料 4.1生物试材 4.1.1试虫 棉铃虫2龄初幼虫（初孵幼虫完成第一次蜕皮后12h以内，虫体为黑色，体重范围为1.0mg～1.5 mg)。 4.1.2供试植物 常规棉花（不含Bt基因或其他抗虫基因）。 1 NY/T2916—2016 4.1.3试验人工饲料 配方参见附录A。 4.2试验药剂 4.2.1杀虫剂原药 4.2.2Cry1Ac原毒素及Cry1Ac活化毒素 （Sigma，T-8642）按照蛋白含量20：1比例于37℃水浴2h，制备Cry1Ac活化毒素。制备不同批次的 Cry1Ac原毒素与活化毒素均需通过SDS-聚内烯酰胺凝胶电泳检测毒素的纯度（原毒素分子量为130 应>99%)。 5试验步骤 5.1试虫采集与饲养 成 卵粒 或从植棉区棉田 随机采集棉铃虫卵 粒以 室内用 群的E 500 测定的虫源。 5.2药液配置 准确称取 虫剂原药 ，用内酮或其他合适的有 机溶剂溶解 m/）用量的 TritonX-100.配制成母液 备用 将Cry1Ad原毒素和活化毒素溶于0.01mol/LpH74的磷酸缓冲液·配 5.3处理方法 R U 5.3.1浸叶接虫法 采集未接触任 何药剂的常规棉 期顶部展开的第 径与24孔组 织培养板孔径相同 个~7个系 水溶 天照等上 LTitOl 列浓度，把圆叶 人药夜 将晾干 标记好的24孔 组织培养板内（培 解后的1mL 琼脂水溶 后备用 每个圆叶片正 养 面向上放置，每孔接 h的 龄初幼虫。 设不含 可药剂的0.1% TritonX-100水溶液 养板盖以防止试 虫逃逸。 5.3.2毒素涂表法 移取60℃左右的人工 同料至24孔 轻轻摇晃至 面平整，孔壁、孔口不得 粘结饲料，室温下自然凝结；将 Ac原毒 舌化毒 用0.01mol/ 7.4的磷酸盐缓冲液按等 比梯度稀释成5个～7个浓度梯度，待饲料冷却固化后，每孔加人 的毒素溶液到饲料表面，置于 头经饥饿4h的2刀幼豆。每个浓度处理48头，并设不含 室温下晾干：在24孔培养板中每孔接入 任何药剂的0.01mol/L、pH7.4的磷酸盐缓冲液作为空白对照；接虫后的培养板用两层黑色棉布覆盖 后再盖上培养板盖以防止试虫逃逸。 5.4结果检查 接虫后的培养板置于恒温光照培养箱[（26土1)℃，RH（60士10）%，16h：8h（L：D）饲养 对于化学杀虫剂，需根据药剂作用特点来确定处理后检查死亡虫数的时间，如拟除虫菊酯类、有机 磷类、氨基甲酸酯类、双酰胺类等杀虫剂处理48h后检查结果；对于杀虫作用较慢的药剂如甲氨基阿维 菌素苯甲酸盐、多杀菌素、氟啶脲等杀虫剂处理72h后检查结果。用毛笔轻触虫体，试虫不能正常爬行 即视为死亡。 对于Cry1Ac原毒素和活化毒素，处理120h后检查结果。完全死亡或生长发育受到严重抑制（体 2 NY/T2916—2016 重小于5mg)即视为死亡。 6数据统计与分析 6.1死亡率计算方法 根据检查数据，计算各处理的校正死亡率。按式（1)和式（2)计算，计算结果均保留到小数点后 两位。 P= 式中： Pi 死亡率，单位为百分率（%） K N 每处理浓度总 虫数 (2) P 式中： P2 校正死亡， 位为百 P, 单位为百分率（%） Po 照死 单位为百分率（%） 对照死亡 率在1 %以下。 6.2回归方程和致死中浓度（c%）计算方法 采用机 值及其95%置信限、斜率（b 标准误。 抗药性水 平的计算与评估 7. 1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 参见附 R 7.2抗性 倍数 的计算 根据敏感品 群的抗 性倍数。 (3) 式中： RR 测试种群的抗性倍数 T 测试种群的 值； S 敏感品系的 7.3 抗药性水平的评估 根据抗性倍数的计算结果，按照表1中抗药性水平的分级标准，对测试种群的抗药性水平做出 评估。 表1抗药性水平的分级标准 抗药性水平分级 抗性倍数（RR），倍 低水平抗性 5.0<RR<10.0 中等水平抗性 10.0<RR<100.0 高水平抗性 RR>100.0 3 NY/T2916—2016 附录A （资料性附录） 棉铃虫人工饲料配方 A.1麦胚粉1200g，大豆粉400g，加水4000mL，放人灭菌锅煮熟（第一次上汽后30min即可，断电后 放汽使气压回到正常值）。 A.2山梨酸10g，酵母粉120g，青霉素2g（100万单位/g），对羟基苯甲酸甲酯20g，维生素C40g，肌 醇2g，微量元素组合342.9mg，混人凉开水中搅拌均匀待用（约200mL）。 微量元素混合物（342.9mg） 26.2 mg 盐酸硫胺素(Thiaminehydrochloride) 盐酸吡多辛（Pyridoxinehydrochloride) 26.2mg 泛酸钙（Calciumpantothenate） 104.3mg 烟胺（Nicotinamide） 104.3mg 0. 6 mg 钴胺素（Cobalamin，vitaminBi2） 核黄素（Riboflavin) 52.5mg 叶酸(Folicacid) 26. 2 mg 生物素（Biotin) 2.6mg A.3琼脂100g，加水2000mL，微波30min至完全融化 A.4将饲料拿出后，稍放凉，加入琼脂搅匀，放凉至60℃左右即可加入A.2配好的溶液及16mL甲 醛，搅拌均匀后倒人相应的容器内。 A.5待饲料冷却后盖上保鲜膜，置于4℃冰箱保存。 A.6若制备的饲料用于生物测定，完成步骤A.1～A.4，将搅拌均匀的饲料放在加热器上加热，可根据 需要加入适量开水。移取饲料至24孔培养板孔底，每孔900uL，轻轻摇晃至液面平整，孔壁、孔口不粘 业标准信息服务平台 结饲料，室温自然凝结备用。 4 NY/T2916—2016 附录B （资料性附录） 棉铃虫对部分杀虫剂及Cry1Ac毒素的敏感性基线 B. 1 棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 见表B.1。 表B.1棉铃虫对部分杀虫剂的敏感性基线 药剂名称 斜率士标准误 LCso（mg/L）（95%置信限） 氯氰菊酯 1.64±0.19 3.52(1.63~6.71) 1.07±0.16 氯氟氰菊酯 1.38(0.67~2.23) 辛硫磷 2.07±0.33 3.51(2.41~4.64) 丙溴磷 1.95±0.21 17.62(6.91~46.48) 多杀菌素 1.78±0.19 1.27(0.97~1.68) 溴虫腈 1.98±0.21 2.77(2.15~3.59) 虫威 1.64±0.21 1.71(1.22~2.30) 氯虫苯甲酰胺 1.40±0.16 0.17(0.11~0.24) 甲氨基阿维菌素苯甲酸盐 1.37±0.15 0.00051(0.00036~0.00069) 氟啶脲 1.61±0.17 4.54(1.90~10.02) 注：敏感品系于20世纪70年代采集自非洲科特迪瓦，由拜耳作物科学公司提供。从2001年至今在南京农业大学饲 养未接触任何药剂。 B. 2 棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性基线 见表B.2。 表 B. 2 棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性基线 药剂名称 斜率士标准误 LCso（95%置信限，μg/cm） 2.56±0.41 CrylAc原毒素 0.033(0.024~0.042) 2.14±0.25 CrylAc活化毒素 0.028(0.021~0.035) 注1：敏感品系于20世纪70年代采集自非洲科特迪瓦·由拜耳作物科学公司提供。