ICS 11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 2960—2016 免病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法 Detectingmethodfor rabbithaemorrhagic disease virus by RT-PCR 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2960—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、江苏省农业科学院兽医研究所、河南牧业经济 学院。 本标准主要起草人：邵卫星、王芳、魏荣、胡波、徐耀辉、魏后军、孙映雪、李卫华。 行业标准信息服务平台 I NY/T2960—2016 免病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法 1范围 本标准规定了检测兔病毒性出血病病毒RT-PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于检测疑似免病毒性出血病肝脏、脾脏、肺脏等脏器及鼻腔分泌物的免病毒性出血病病 毒核酸。 缩略语 下列缩略语适用于 本文件 EB：溴化乙锭（e hidiun Oligo d(T)18 rim RHD:兔病毒 性出 ribbruo RNA：核糖 核酸 eicacid) RT-PCR 反转 酶链式反 reversetranscriptlo bolymeras action)。 EARCH Taq酶:1 NA聚 酶（tagDNApolymera a 缓冲液 TBE:Tr bp:碱基 对 dNTPs: 核糖核 磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphates) 3 仪器设备 3. 1 高速冷冻离 3. 2 PCR扩增 C 3. 3 核酸电泳仪利 3. 4 恒温水浴锅 3.5 2℃~8℃冰箱 8% 3. 6 微量移液器（0. 10μL 200100 3.7 凝胶成像系统（或紫） 小透射仪） 3.8 生物安全柜。 服务平台 4试剂 4.1 AMV反转录酶或其他反转录酶。 4.2 RNA酶抑制剂。 4.3 TaqDNA聚合酶。 4. 4 dNTPs. 4.5 TRIZOLRNA提取试剂。 4.6 1.0%琼脂糖凝胶，见A.1。 4.7 5XTBE缓冲液，见A.2。 4.8 DNA染料：溴化乙锭（EB）。 1 NY/T2960—2016 警告：电泳中用到的EB可诱发基因突变，在操作中应戴手套和口罩。试验中被EB污染的物品要 有专用收集处，并进行无害化处理。 4.9焦碳酸二乙酯（DEPC)水，见A.3。 警告：DEPC对眼睛和呼吸道黏膜有强刺激，在操作中应在通风条件下进行。使用时戴手套和口 罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 4.10异丙醇：一18℃以下预冷。 4.1175%乙醇：-18℃以下预冷。 4.12氯仿。 警告：氯仿毒性属中等毒性，吸入或经皮肤吸收会引起人体不适及皮肤黏膜刺激症状，在操作中应 在通风条件下进行。使用时戴手套和口罩，不小心沾到皮肤应立即冲洗。 4.13DNA分子量标准（DL2000DNAMarker）。 4.146×电泳上样缓冲液。 5引物 5.1反转录引物见B.1。 5.2PCR引物见B.2。 6操作程序 6.1 样品的采集及处理过程的注意事项 采样过程中样本不得交叉污染，采样、样品处理及RNA提取过程中应戴一次性手套和口罩。 6.2样品的采集及处理 6.2.1肝脏等脏器的采集和处理 无菌取疑似RHD死亡免肝脏等脏器5g，分别剪碎作为检测样品。同时，以RHD死亡兔和正常兔 肝脏等脏器分别作为阳性和阴性对照样品，同样处理。一18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需 加冰袋保存。 6.2.2鼻腔分泌物的采集和处理 用DEPC水润湿棉签拭子，深入兔鼻腔内部涂抹数次，然后放到含0.2mLDEPC水的EP管中。 一18℃以下冰箱可保存1个月。运输过程中需加冰袋保存。 6.3RNA的提取 6.3.1TRIZOL法 实验室没有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。 将5倍样品量的DEPC水加人脏器组织中，研磨成悬液，装入DEPC处理过的EP管中，一18℃以 下反复冻融3次，5000g离心5min，取200μL上清液作为待提取样品（浸泡于EP管中的棉签子，经 反复挤压5次后，5000g离心5min，取200μL上清液作为待提取样品）。然后，加人700μLTRIZOL， 振荡混匀后，室温放置10min，加人氯仿300μL。振荡混匀后，室温放置30min，4℃10000g离心15 min。取上层水相600μL，加人等体积的异丙醇，混匀，一18℃以下放置2h以上或过夜，4℃10000g离 心15min，去上清液，缓缓加人75%乙醇1mL洗涤，4℃5000g离心5min，去上清液，室温干燥20 min，加人DEPC水10μL，使充分溶解。 6.3.2试剂盒法 实验室有商品化RNA提取试剂盒采用此方法。 6.4反转录(RT) 2 NY/T2960—2016 6.4.1RT反应体系 RNA 5.75μL dNTPs(10mmol/L) 1.0 μL RNA酶抑制剂（RNaseInhibitor)（40U/μL） 0.25μL AMV反转录酶（5U/μL） 0.5μL 5XAMV反应缓冲液 2.0μL Oligod(T)18（反转录引物） 0.5μL 总体积（Total） 10.0μL 6.4.2RT反应程序 30℃10min，42℃30min，99℃5min，取出，可以直接作为模板进行PCR，或者放于一18℃以下保 存备用。试验中同时设立阳性对照和阴性对照。 6.5 PCR 6.5.1PCR反应体系 MgCl(25mmol/L) 1.5μL 反转录产物 4.0μL 10XTaqDNA聚合酶反应缓冲液 2.5μL dNTPs(10 mmol/L) 0.5μL 上游引物（50pmol/μL） 0.5μL 下游引物（50pmol/μL） 0.5μL TaqDNA聚合酶（5U/μL） 0.5μL 15.0 μL 灭菌去离子水 总体积(Total) 25.0μL 6.5.2PCR反应程序 94℃5min；94℃30s.56.8℃30s.72℃45s，25个循环72℃延伸10min，结束反应。 6.6扩增产物的电泳检测 6.6.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见A.1。 6.6.2取10.0μLPCR产物与2.0μL6×上样缓冲液混合，加人琼脂糖凝胶板的加样孔中，同时加入 DNA分子量标准。 6.6.3盖好电泳仪，插好电极，5Vlcm恒压下电泳30min。 6.6.4用紫外凝胶成像系统在302nm波长的紫外下观察，并对图片拍照、存档。 6.6.5用分子量标准比较判断PCR片段大小。 7结果判定 7.1试验结果成立条件 检测均未出现约591bp的特异性条带。阴、阳性对照同时成立则表明试验有效，否则试验无效 7.2阳性判定 条带，判定为该样品免病毒性出血病病毒核酸阳性，如需要进一步确认，可进行测序分析（序列参见附录 C)；若条带极弱，难以判定，需重新做一次试验，在约591bp的位置出现特异性条带，可判定为该样品兔 病毒性出血病病毒核酸阳性，如需要进一步确认，可进行测序分析（序列参见附录C)，若目的条带仍然 极弱，可判定为该样品兔病毒性出血病病毒核酸可疑，需用其他方法检测。 3 NY/T2960—2016 7.3阴性判定 在试验结果成立的前提下，在约591bp位置未出现特异性条带，可判定为该样品免病毒性出血病 病毒核酸阴性。 8案例 检测10份家免肝脏样品的操作术式参见附录D。 服务平台 NY/T2960—2016 附 录A （规范性附录） 试剂的配制 A.11.0%琼脂糖凝胶 琼脂糖 1.0 g PUBL 0. 5 X TBE 电泳缓冲液 加至100 mL 微波炉中完全 15 .摇匀，倒入电泳板上，凝固 后取下梳子，备用。 糖凝胶 冷 至50% 化乙 锭（EB溶液15μL，摇匀， 倒入电泳板上 凝固 包 后 A. 2 5×TBE缓 水 乙酸二钠 NEDTA 2HO) 甲烷（TH 日 硼酸 27 加至 2℃ A.3 DEPC 焦砖 E（DEPC) 100 火菌 100 室温过 夜 高压 装到DEPC处理过的EP管 2℃~8 保 际 服务平台 5