ICS11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 29622016 奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、 凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分 离鉴定方法 Methods for isolation and identification of Staphylococcus aureus,coagulase-negative Staphylococcus and Streptococcus agalactiae in milk from dairy cow with mastitis 业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部 发布 NY/T2962—2016 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所。 本标准主要起草人：王旭荣、李宏胜、李建喜、杨峰、王学智、张世栋、李新圃、杨志强、王磊、罗金印。 行业标准信息服务平台 I NY/T2962—2016 奶牛乳房炎乳汁中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、 无乳链球菌分离鉴定方法 1范围 本标准规定了奶牛乳房炎乳汁中病原性金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌的分离 和鉴定方法。 本标准适用于奶牛乳房炎（临床型乳房灵和隐B乳房炎）的病原菌诊断.所分离的病原菌可进一步 开展药物敏感性检测 规范性引用文 下列文件又 寸于 不可少的 凡是注日期的引用 文件双 注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的用文件，其最新版本（包括所有的修必单）适用于 分初实 GB/T 6682 验室用水规格和试验方法 GB19489 实验室 生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语 文件。 3. 1 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ENT 房炎的主要病原菌 之一。 3.2 凝固酶阴性葡高球菌 agulase enegativeStaphylococcus,CNs 类血浆凝固酶 试验为生 色 的常居菌，常见的CNS 主要包括表皮葡萄球菌溶血葡毒 腐生葡萄球菌、路邓葡萄球菌 葡萄球菌、产色葡萄球菌、鸡 葡萄球菌、沃氏葡萄球菌等20多种 3.3 无乳链球菌Streptococusagalactiae 种CAMP试验为阳性、革当 洗色为阳件 引起奶牛乳房炎的主要病原菌之一 3.4 CAMP试验CAMPtest CAMP是Christie，Atkins，Munch-Peterson等人名的缩写，因本试验是他们三人所创建。CAMP 试验的原理是原来不溶血或溶血不明显的无乳链球菌，在有金黄色葡萄球菌产物存在时，呈明显的β型 溶血，可区分无乳链球菌、停乳链球菌和乳房链球菌。在本标准中，用于无乳链球菌的鉴定。 3.5 nuc基因thermonucleasegene 耐热核酸酶是金黄色葡萄球菌的一种毒力因子，100℃作用15min不失去活性，一般由致病菌产 生。nuc基因是编码耐热核酸酶的基因序列，在本标准中，nuc基因用于金黄色葡萄球菌的PCR鉴定。 1 NY/T2962—2016 3. 6 sip基因 surfaceimmunogenicproteingene sip蛋白是无乳链球菌的一种表面免疫相关蛋白，是暴露在菌体表面的一种具有黏附和定植作用的 因子。sip基因是编码sip蛋白的基因序列，基因序列保守。在本标准中，sip基因用于无乳链球菌的 PCR鉴定。 4采样前检查 4.1总则 在采集乳样前，首先对乳房外观和乳汁性状进行观察。 4.2 2临床型乳房炎的检查 临床型乳房炎的检查至少包括以下5个方面： a） 乳房的大小、颜色、对称性和硬度： 乳房是否有发红、肿胀和发热；触摸时奶牛是否有疼痛反应及有无外伤或瘘管； b) c） 乳汁的气味和颜色； d）乳汁有无絮片、凝块； e）奶产量的变化。 4.3临床型乳房炎的判定 奶牛乳区出现红、肿、热、痛或乳汁性状改变（乳汁颜色改变，或乳汁呈水样或有絮状或有乳凝块或 血乳等症状，则可判定为临床型乳房炎。 4.4隐性乳房炎的检查与判定 隐性乳房炎可参照NY/T2692的规定进行检验判定，也可用商品化的隐性乳房炎诊断试剂进行 检验判定。 5奶牛乳房炎病牛乳样的采集 5.1试剂与材料 乳样采集管：配制方法见A.1；生物冰袋或冰块。 5.2 2操作方法 先用温水清洗乳房，然后依次用0.2%新洁尔灭浸泡的脱脂棉或纱布、75%酒精棉擦拭消毒乳头。 每个乳头弃去初始2把～3把奶，然后按无菌操作规程分别采集每个乳室的乳样约5mL。采集的乳样 保存于乳样采集管中，立即检验。如需运输送检，在运输过程中加人生物冰袋或冰块使乳样温度保持在 信息服务平台 2℃～8℃，并保证在10d以内送到相关实验室。 5.3样品记录 样品记录至少应包括以下4项内容： a）送检人的姓名和奶牛场的名称或地址； b）牛号和乳室； c）采样日期； d）送检日期。 5.4乳样中的细菌分离鉴定流程 奶牛乳房炎乳样中金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、无乳链球菌分离鉴定流程图见附录B。 乳样接种和增菌 6 6.1器材和设备 2 NY/T2962—2016 恒温培养箱（37℃）、冰箱（4℃）、洁净工作台、pH计、接种环、天平（精度为0.01g）。 6.2试剂与材料 血琼脂平板、改良营养肉汤（配制方法见A.2）。 6.3操作方法 将待检乳样摇匀，无菌操作，用接种环取2环～3环待检乳样，间断划线接种于血琼脂平板上，置 37℃恒温培养箱中培养18h～24h，观察细菌生长情况。对培养18h～24h无细菌生长的血琼脂平板， 培养时间延长至48h。若血琼脂平板上仍无菌落生长，则取该乳样50μL，接种到改良营养肉汤中进行 增菌培养，培养18h～24h。然后，将增菌培养物间断划线接种于新的血琼脂平板上，培养24h～48h， 再观察细菌生长情况。 6.4结果判定 乳样在血琼脂平板上接种培养18h～48h，如肉眼观察到菌落，则判定乳样中有细菌，然后对血平 板上生长的菌落按照第7章的规定进行初步鉴定。 增菌培养物在血琼脂平板上接种培养24h～48h，如肉眼观察到菌落，则判定乳样中有细菌，然后 对血琼脂平板上生长的菌落按照第7章的规定进行初步鉴定；如培养至48h仍无细菌生长，则判定乳 样中无细菌。 7初步鉴定 7.1器材和设备 光学显微镜、恒温培养箱（37℃）、洁净工作台、冰箱（4℃）、pH计、接种环、天平（精度为0.01g）。 7.2试剂与材料 革兰氏染色液、血琼脂平板。 7.3菌落观察 肉眼观察血琼脂平板上的菌落。 7.4菌落观察结果判定 7.4.1当菌落为圆形、光滑凸起、湿润、边缘整齐颜色呈金黄色、灰白色、乳白色或柠檬色，直径0.5 mm1.5mm的大菌落，溶血或不溶血，可初步判定为葡萄球菌属。 7.4.2当菌落为圆形、光滑凸起、湿润、边缘整齐，颜色为灰白色或毛玻璃色，透明或半透明的小菌落或 针尖大小的菌落，溶血β溶血或不溶血，可初步判定为链球菌属。 7.5革兰氏染色镜检 分别挑取步骤7.4中疑似菌落进行革兰氏染色，将染色菌样置于显微镜油镜下观察。 7.6革兰氏染色镜检结果判定 如果镜检观察到菌体为革兰氏阳性（G）.形态为圆形或椭圆形，成对状、丛状、葡萄串状或链状排 列的细菌，初步定为G球菌。 7.7纯化培养 挑取步骤7.6中初步判定为G球菌的单个菌落，间断划线接种于新的血琼脂平板上，置37℃恒温 培养箱中进行纯化培养18h～24h后，再次按7.4、7.5进行判定和革兰氏染色镜检。 如果镜检为纯净的G球菌，则可进行接触酶试验。纯净的葡萄球菌属细菌镜检观察到菌体为革 兰氏阳性（GT），形态为圆形，成对状、丛状或葡萄串状；纯净的链球菌属细菌镜检观察到菌体为革兰氏 阳性（G），形态为圆形或椭圆形，成对状或链状排列。如果不纯净，重复本步骤，直至镜检菌落纯净。 7.8属别鉴定 7.8.1总则 对7.7中镜检观察为G球菌的纯净菌落进行接触酶试验。 3 NY/T2962—2016 7.8.2试验试剂 3%H2O2溶液：配制方法见A.3。 7.8.3接触酶试验操作方法 取3%H2O2溶液1滴～2滴置于干净载玻片上，然后加一接种环被检细菌菌落，与H202滴液混 合，立即产生气泡者为阳性，不产生气泡者为阴性。 7.8.4结果判定 G+球菌，且接触酶试验阳性（十），初步判定为葡萄球菌属； G+球菌，且接触酶试验阴性（一），初步判定为链球菌属 8定性鉴定 8.1凝固酶阴性葡萄球菌的定性鉴 定 8.1.1总则 ARD 将步骤7.8.4中鉴定为 IN 的细菌进行 浆凝固酶 8.1.2器材和设备 恒温培养箱 羊台、冰箱 8.1.3试剂与材料 S 8.1.3.1兔血浆 配制方法见 免血 A 浆也可用商品化的试剂，按说明操作 兔血浆凝固酶阳 阳性菊 萄球菌菌材 8.1.3.3阴性对照 空白兔血浆 C 8.1.4兔血浆凝固 酶试验操作方法 养物 L，总体积为 取新鲜配置 血浆 再加人待检细 0.6mL.震荡摇匀 同时设立阳性对照和阴性对照 A 察一次，观察 6h，如呈现凝固（即将试普额） 块）或凝固体和大于总体积 611 半，则判定为 出现凝 的 M 阳性结果。 8.1.5结果判定 R 葡萄球菌属的细菌，且符合兔血浆 ）则判定为凝固酶 性葡萄球菌； 葡萄球菌属的细菌，且行 血浆凝固酶 ）则判定为凝固 阳 阳性葡萄球菌。 8.2金黄色葡萄球菌的定性鉴定 8.2.1Baird-Parker琼脂平板筛选 8.2.1.1总则 将步骤8.1.5中判定为凝固酶阳性葡萄