ICS11.220 B 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T2959—2016 兔波氏杆菌病诊断技术 Diagnostic technique for bordetella caniculum 行业标准信息服务平台 2016-10-26发布 2017-04-01实施 中华人民共和国农业部发布 NY/T2959—2016 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、西北农林科技大学 本标准主要起草人：王娟、赵思俊、郑增忍、曲志娜、张彦明、王玉东、张耀相。 行业标准信息服务平台 一 NY/T2959—2016 兔波氏杆菌病诊断技术 1范围 本标准规定了免波氏杆菌病的微生物学诊断、玻片凝集试验等技术要求。 本标准适用于兔波氏杆菌病的诊断、检疫及流行病学调查。 试剂与器材 2.1试剂 2.1.1痢特灵改良 肉汤增面 窗液 2.1.2鲍一姜氏 琼脂平 板： 2.1.3绵羊鲜 血改良鲍 配制方法见A. 2.1.4改良麦康凯（痢特灵 琼脂平板配制 2. 1. 5 葡萄糖蛋白月 配制方法见 A 2.1.6 营养肉汤：配制 法见A.6 2. 1.7 制方法见 2. 1. 8 物试剂公司生产 2. 1. 9 2 May 2. 1. 10 琼脂糖 2. 1. 11 AE缓油 2. 1. 12 漠 2. 1. 13 DNA L2000 2.1.14菌株来源 大肠杆菌ATCC25922购自中国 鲁药监 2.2器材 2.2.1剪刀、镊子 2.2.2解剖手术刀 2.2. 3 显微镜：10×~100 2.2. 4 生物安全柜 服务平台 2.2.5接种针或接种环。 2.2.6恒温培养箱：[（10~50）±1]℃。 2. 2.7 恒温水浴锅：20℃~100℃。 2. 2. 8 基因扩增仪。 2.2.9电泳仪。 2. 2. 10 凝胶成像系统。 2.2.11 高速冷冻离心机：12000r/min。 2. 2. 12 冰箱：4℃。 2. 2. 13 微量加样器：200μL、1000μL。 1 NY/T2959—2016 3流行病学 免波氏杆菌病是由支气管波氏杆菌引起的一种慢性呼吸道传染病。该病传播广泛，在兔群中的感 染率非常高，常呈地方性流行，多为慢性，急性败血性死亡较少。多发于气候易变化的春秋两季，主要经 呼吸道传播，带菌兔和病兔鼻腔分泌物中的病菌随咳嗽、喷嚏飞沫污染饲料、饮水、笼舍和空气传染健 康兔。 4临床症状 4.1鼻炎型 病免精神不佳，闭眼，鼻腔流出浆液性或黏液脓性分泌物。病兔打喷嚏，呼吸困难，经常用前爪抓擦 鼻部，鼻孔周围及鼻腔黏膜充血，流出多量浆液性或黏液性分泌物 4.2支气管肺炎型 5病理学变化 鼻腔、气管黏膜充血、水肿，鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。严重病例可见鼻甲骨萎 缩。肺部多见于心叶和尖叶有大小不一的病灶，重症病例侵及全肺叶，病变部稍隆起、坚实、呈暗红色、 褐色；有些病例肺有脓包，肝脏表面也有散在脓包，脓包内积有黏稠奶油样乳白色脓汁。 6 微生物学诊断方法 6.1采样 6.1.1发病免样品采集及处理 用75%酒精棉签，对兔双侧鼻孔前及正前庭0.5cm处进行消毒。然后，用肉汤湿润的无菌小棉签， 分别在鼻孔内1cm处旋转采取鼻黏液，无菌操作放人痢特灵改良肉汤增菌液中。 6.1.2死亡兔样品采集及处理 无菌操作采取病变的肝脏、脾脏、肺脏少许放入无菌塑封袋中，吸取2mL～3mL胸腔渗出液。样 品2℃～8℃保存，2h内送实验室进行细菌分离培养。 6.2细菌形态观察 将病料制作抹片2张～3张，分别用革兰氏染色和美蓝染色，油镜下观察。免波氏杆菌病料抹片镜 下观察细菌形态：革兰氏染色阴性，小球杆菌散在分布于病变组织中；细菌的外围有不易着色透亮的黏 液圈，在中性粒细胞外围最容易找到兔波氏杆菌。美蓝染色，蓝紫色小球杆菌，无两极着色现象。 6.3分离培养 6.3.1接种 对鼻黏液采集的棉拭子直接划线接种改良麦康凯（痢特灵）琼脂培养皿4个（其中，间断划线法接种 2个平血，连续划线法接种2个平血）；肝脏、脾脏、肺脏及胸腔渗出液，每种脏器接种2个绵羊鲜血鲍 姜氏平板.用接种环在平板上先涂抹0.5cmX（2～3）cm大小，然后用接种环分别采取间断和连续划线 接种全部平板，37℃24h~48h培养。 6.3.2可疑菌落初选 在改良麦康凯（特灵）琼脂平板上为中等大小、圆形、表面光滑、边缘整齐、湿润、透明呈茶色菌落； 或者在绵羊鲜血鲍一姜氏平板上为灰白色、圆形、凸起、表面光滑、边缘整齐、有明显的β溶血环的中等 大小菌落，为兔波氏杆菌可疑菌落。 6.4染色镜检 2 NY/T2959—2016 革兰氏阴性，多单在或成双，呈微小杆菌或微小球杆菌。I相菌呈整齐的类球菌、球杆菌，染色均 匀，大小为0.2um×0.3um，无芽孢，散在排列；Ⅲ相菌中等大小杆菌，个别呈丝状、散在排列，大小为 0.4μm×0.5μm，无微荚膜，无芽孢，着色均匀。 6.5生化鉴定 6.5.1生化实验 挑取符合6.3.2特征的2个以上可疑菌落，按照商业化的生化反应管说明书进行生化试验。 6.5.2生化特性 兔波氏杆菌在三糖铁琼脂斜面产碱，红色加深，底层无变化。其他生化反应结果见表1。 表1# 波氏杆菌生化反应结果 生化试验项目 反应结果 生化试验项目 反应结果 葡萄糖 甲基红 乳糖 VP试验 麦芽糖 靛基质 蔗糖 硫化氢 甘露醇 明胶 果糖 触酶试验 + 鼠李糖 氧化酶试验 + 阿拉伯糖 尿素 + 水解精氨酸 硝酸盐试验 + 酪氨酸 赖氨酸脱羧酶 精氨酸脱羧酶 天门冬素 6.5.3生化鉴定结果 符合6.5.2生化特性的细菌可确认为兔波氏杆菌。 6.6PCR鉴定 6.6.1模板制备 挑取符合6.3.2特征的单个菌落，悬浮于1.5mL微量离心管灭菌纯水中，在4℃条件下10000g 离心5min。除去上清液后，将沉淀悬浮于25μL双蒸水中，并水浴煮沸10min，然后冰浴10min， 10000g离心10min，上清液为DNA模板.用于扩增其16SrDNA。对阳性对照（标准菌株CUCC718） 和阴性对照（大肠杆菌ATCC25922）同步进行DNA提取。 6.6.2PCR扩增 6.6.2.1引物序列 上游:5'-ATAGAATTCATGAAGCACTTTCGCCCCCACC-3; 下游:5'-GCCAAGCTTCTAAGGATAGATGACCGAAAAG-3 6.6.2.2反应体系 每个样品建立25μLPCR反应体系，包括： O"HPP 9.5μL DNA模板 2.0 μL 2XTaq MasterMix 12.5μL 上、下游引物混合物（10μmol/L） 1.0μL 先95℃变性5min，然后按94℃变性30s、68.4℃退火30s、72℃延伸60s的顺序循环，共循环35 3 NY/T2959—2016 次，最后在72℃温度下延伸10min，于4℃保存。 6.6.3PCR产物电泳 取5μuLPCR扩增产物与2μL加样缓冲液混合后加人点样孔进行电泳，电压5V/cm～9V/cm， 20min～30min。用凝胶成像仪观察分析电泳结果。 6.6.4结果判定 6.6.4.1实验成立的条件 6.6.4.2结果判定 试验成立，样品孔扩增出648bp大小的扩增条带.则判定待检菌株为波氏杆菌阳性，否则判为阴性 (PCR检测结果判定参见B.1 必要时，可对该扩增 测序鉴定进行确认（参见B.2)。 B 7抗体诊断方法（玻片凝集试验 7. 1 抗原制备 将标准菌株接 C培养48h，用中 天活48h，其间振 摇数次，8000/mm离 ni 取沉积菌体， ·用PBS洗涤30N 八调节菌 1/mL，即为抗 明液体， 原，其状态为清亮 保存备用 般保质期为1年 S 7. 2阴性血清 阳性血清和 口待检血清准备 JRAL 7.2.1阴性血清 SPF兔血清 7.2.2阳性血清 ：8以上，-20℃保存 兔波氏杆菌标 SPF兔获得，血清 效价在 7.2.3待检血清 CEI 离血清。 7.3操作方法 在干净的玻 被 室温（20℃~ 25℃）下2min，室温在 百延长 果 7.4结果判定 7.4.1结果判定标准 按照凝集情况，凝集强度表示如下 和血清 合后2min内液清 出现大凝集块或颗粒状凝 集物，液体完全清亮。 “+++”，表示约75%菌体被凝集 “+十”，表示约50%菌体被凝集。液滴中有少 见的颗粒状凝集物，出现较迟缓，液体不透明。 “+”，表示25%以下菌体被凝集。液滴中仅有很少量粒状物，出现迟缓液体浑浊。 “二”，表示菌体无任何凝集。液滴均匀浑浊。 7.4.2实验成立的条件 阳性血清对照出现明显的颗粒，凝集强度为“十十十十”，而阴性血清对照无颗粒，凝集强度为“一” 则试验成立，否则不成立。 7.4.3结果判定 符合7.4.2的条件，待检样品出现7.4.1中“十十”以上反应，判定为阳性，“十”至“二”反应，判定为 阴性。 4 NY/T2959—2016 8 诊断结果判定 对发病免群的检疫应综合应用临床症状、微生物学诊断及抗体检测，并选择样品病免作病理学检 查。待检免群诊断有鼻腔流出分泌物、鼻甲骨萎缩、肺部病变的临床病状，鼻腔分泌物及内脏器官检出 兔波氏杆菌，判定波氏杆菌感染。非免疫兔群检出兔波氏杆菌抗体的兔，判定为支气管波氏杆菌感染血 清阳性。 服务平台