ICS 65.020.20 B 61 中华人民共和国林业行业标准 LY/T 3107—2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 Technical regulationfor willowvarieties identificationbySsR markers （发布稿） 行业标准信息服务平台 2019-10-23发布 2020-04-01实施 发布 国家林业和草原局 LY/T3107—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草。 本标准由全国林木种子标准化技术委员会（SAC/TC115）提出并归口。 本标准主要起草单位：南京林业大学。 本标准参加起草单位：江苏省林业科学研究院：山东省林业科学研究院。 本标准主要起草人：李淑娴、戴晓港、尹佟明、陈赢男、刘德玺、何旭东。 行业标准信息服务平台 LY/T3107—2019 柳树品种微卫星标记鉴别技术规程 范围 本标准规定了以柳属(Salix)植物DNA为材料，利用微卫星标记(microsatellite)对国家和省审(认)定 的柳树品种进行分子鉴定的规范化操作技术。 本标准适用于附录A中所列柳树品种的鉴别。 2术语和定义 2.1微卫星标记microsatellite 微卫星标记，又被称为短串联重复序列(shorttandemrepeats,STRs)或简单重复序列(simplesequence repeats，简称SSR)，是指基因组中由2～6个核苷酸组成的DNA串联重复序列。 2.2基因型频率genotype frequency 3操作程序 3.1取样和保存 取柳树幼嫩叶片5片～10片，用干燥硅胶密封保存，用于DNA提取， 3.2DNA提取所需试剂 a)1MTris：称取12.11gTris溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。 b)0.5MEDTA：称取18.61gEDTA溶解到80mL超纯水中，调节pH=8.0，定容到100mL。 c)5M氯化钠：称取23.38g氯化钠溶解到80mL超纯水中，定容到100mL。 d)5M醋酸钾：称取25.54g醋酸钾，200mL超纯水溶解后定容到250mL。 e)2%SDS：称取1.0g十二烷基硫酸钠(SDS)，40mL超纯水溶解后定容到50mL。 f)10%CTAB：称取10gCTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶解到80mL超纯水中，定容 到100mL。 g）氯仿异戊醇：240mL氯仿，10mL异戊醇混合。 h)70%乙醇：70mL乙醇，加入30mL超纯水。 i)CTAB裂解液:1mL1MTris(pH=8.0),4mL0.5MEDTA(pH=8.0)，28mL5M氯化钠，10mL10% CTAB，5g聚乙烯吡咯烷酮，定容到100mL。 1 LY/T3107—2019 800mL双蒸水溶解后定容到1L，高温灭菌。 3.3DNA提取 DNA提取采用改良的CTAB法： a）向2mL离心管中加入400μLCTAB裂解液，10μL的10mg/mLRnase，2μLβ-疏基乙醇。 b）取柳树叶片3-5片，放入研钵中加入液氮充分研磨，将研磨后的样品转入3.2.1的离心管中， 涡旋混匀后，65℃保温10min，再加入400μL2%SDS，涡旋混匀，65℃保温10min。 d）加入800μL氯仿异戊醇溶液（氯仿：异戊醇=24:1)，涡旋混匀后，12000rpm离心5min。 e）将上清液转移到新的2mL离心管中，加入等体积预冷的异丙醇，颠倒离心管8-10次，-20℃冻 存20min。 f）取出离心管，12000rpm离心5min，去除上清液。 g）加入500μL的70%乙醇，12000rpm离心2min，去除上清液。 h）重复3.2.7步骤一次。 j）加入100μLTE缓冲液，37℃保存5min，涡旋混匀获得DNA，将样品放在-80℃长期保存。 3.4DNA定量及质量检测 a）取2μLDNA用微量核酸蛋白检测仪检测，直接读出DNA浓度和A260/280的比值。 b）根据上述测定浓度，取200ngDNA，加入2μL溴酚蓝，在1%的琼脂糖凝胶上电泳，加入5000 bpmarker作对照，稳压100V，电泳缓冲液为1XTBE，电泳结束后用凝胶成像系统记录拍照。 c）根据微量核酸蛋白检测仪的定量结果，将样品稀释成20ng/μL，在-20℃下保存备用。 3.5目的片段PCR扩增 3.5.116对SSR引物及序列见附录B。 3.5.2目的片段扩增反应体系为15μL，具体试剂用量见表1。 表 1 PCR扩增反应体系 所需体积(μL) 试剂 浓度 PCR buffer 10×PCR buffer(Mg2+ Plus) 1.5 5 U/L Taq酶 0.2 Forward Primer 5 mM 1 Revere Primer 5mM 1 DNA 20 ng/μL 2 dNTP 5 mM 0.3 dUTP 250 nM 2