ICS 65.100.01 CCS G 24 黑 龙 DB23 江 省 地 方 标 准 DB23/T 3188—2022 花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备技术规程 2022-05-09 发布 黑龙江省市场监督管理局 2022-06-08 实施 发 布 DB23/T 3188—2022 前 言 本文件按照 GB/T 1.1—2020《标准化工作导则 第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则》的规 定起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由黑龙江省农业标准化技术委员会提出。 本文件起草单位：哈尔滨瑞康源生物科技有限公司、黑龙江省绿色食品科学研究院。 本文件主要起草人：王英男、黄艳玲、刘容旭、吴春梅、王英鹏、刘丽、王克红。 I DB23/T 3188—2022 花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备技术规程 1 范围 本文件规定了花卉用戊糖乳杆菌细菌素制备的术语和定义、材料和设备、技术要求、保存方法和技 术档案。 本文件适用于花卉用戊糖乳杆菌细菌素的制备。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 4789.35—2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验 NY/T 1114—2006 微生物肥料实验用培养基技术条件 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 戊糖乳杆菌 LS1 戊糖乳杆菌LS1是从发酵蔬菜中分离出来的一种乳酸菌类微生物。 4 材料和设备 4.1 4.1.1 材料 菌种 细菌素生产菌株：戊糖乳杆菌LS1菌株；指示菌株：单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes） CMCC 54004和大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 25922菌株。 4.1.2 培养基 选择 MRS(Man Rogosa Sharpe)培养基为菌株活化、计数和发酵用培养基。MRS 培养基配方按照 GB 4789.35—2016 中附录 A 的规定执行，培养基的配制方法按照 NY/T 1114—2006 中第 4 章的规定执行。 4.1.3 试剂与耗材 硫酸铵、20 mmol/L醋酸盐缓冲液（pH 3.8）、牛津杯、0.22 µm孔径的硝酸纤维素膜、Sephadex G-10 色谱柱。 4.2 设备 1 DB23/T 3188—2022 超净工作台、细菌厌氧培养箱、pH计、真空冷冻干燥机、752紫外可见分光光度计和高效液相色谱 仪。 5 技术要求 5.1 菌株培养 8 将活化后的戊糖乳杆菌LS1接种到MRS液体培养基中，并培养至对数生长期（有效活菌数达10 CFU/mL，计数方法按照NY/T 1114—2006中第6章的规定执行）作为培养物。将5%的戊糖乳杆菌LS1（18 h 菌龄）培养物接种到MRS液体培养基上，37 ℃厌氧培养42 h，8 000 r/min离心15 min后，通过0.22 µm 膜过滤得到上清液与菌体，取上清液用3.0 mol/L NaOH溶液将pH值调至6.5，冻干备用。 5.2 细菌素分离 取 15 g 冻干样品溶于 1 000 mL 去离子水，用 60%饱和度的硫酸铵，在转速 120 r/min 条件下搅拌 24 h，然后 10 000 r/min、4 ℃离心 20 min，通过 0.22 µm 孔径的硝酸纤维素膜过滤分别得到上清液 与沉淀。以单核细胞性李斯特菌 CMCC 54004 和大肠杆菌 ATCC 25922 为指示菌，采用琼脂扩散牛津杯法 分别测定沉淀复溶液与上清液的抑菌圈直径，并以没有接菌的培养基经硫酸铵沉淀后的沉淀复溶液作空 白对照。 5.3 细菌素纯化 5.3.1 初度纯化 离心过滤后的上清液通过Sephadex G-10柱液相色谱系统脱盐并纯化，以超纯水为缓冲液，流速为6 mL/min，然后在280 nm紫外波长检测细菌素，采用琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。 5.3.2 中度纯化 将 Sephadex G-10 柱液相色谱系统脱盐并纯化得到的细菌素粗品在 pH 3.8 的 20 mmol/L 醋酸盐缓 冲液条件下进行 SP Sepherose Fast Flow 纯化，用 NaCl 溶液梯度（0 mol/L～0.5 mol/L）线性洗脱细 菌素，流速为 5.0 mL/min。然后在 280 nm 紫外波长紫外检测细菌素，并测定其抑菌活性。然后合并活 性流份，用 Sephadex G-10 柱液相色谱系统脱盐后，真空冷冻干燥。 5.3.3 精细纯化 采用 Superdex 30 Increase 作为最后一步纯化介质，通过 Sephadex G-10 柱液相色谱系统脱盐并 纯化，用 5 mL 醋酸盐缓冲液溶解冻干样品，使用 Superdex 30 Increase，平衡 2 次柱体积，在 pH 5.2 条件下洗脱，洗脱的摩尔浓度乘以体积为 1.5 V，在 280 nm 紫外波长处检测细菌素，流速 1.0 mL/min， 每 6 mL 为一管进行收集，通过琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。 6 保存方法 使用冻干机将细菌素制成冻干制品，于 4 ℃～8 ℃以下保存。 7 技术档案 2 DB23/T 3188—2022 应建立技术档案，内容包括：菌种、培养基、试剂及耗材、设备、菌种培养、细菌素分离、细菌素 纯化等。 3 DB23/T 3188—2022 参 考 文 献 [1] 李志如等.戊糖乳杆菌 LS1 细菌素的分离纯化及性质鉴定. [J].食品科学,2020. 4