中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T1694—2011 代替SN/T1694—2006 马疫检疫技术规范 Quarantineprotocolfordourine 2011-09-09发布 2012-04-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T1694—2011 言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草 本标准代替了SN/T1694一2006《马嫌疫微量补体结合试验操作规程》。 本标准与SN/T1694一2006相比，主要技术变化如下： 增加了临床检查； 一增加了间接荧光抗体试验； 增加了酶联免疫吸附试验。 本标准与OIE《陆生动物诊断试验与疫苗手册》(2010修订版)第2.5.3章一致性程度为非等效。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：朱来华、郑小龙、贾赞、简中友、肖西志、邓明俊、岳志芹、梁成珠、辛学谦、 谭乐义、王群、孙涛、赵玉然、王宫璞。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T1694—2006。 SN/T1694—2011 马嫌疫检疫技术规范 范围 1 本标准规定了马嫌疫的临床检查、补体结合试验、间接荧光抗体试验和酶联免疫吸附试验等诊断 技术。 本标准适用于马嫌疫的诊断和检疫。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3临床检查 参见附录A。 血清学鉴定技术 4.1 补体结合试验 4.1.1 材料准备 4.1.1.1 被检血清：见附录B。 4.1.1.2 绵羊红细胞：见附录B。 4.1.1.3 补体：冻干品。 4.1.1.4 马嫌疫阴性血清、阳性血清。 4.1.1.5 马嫌疫补体结合抗原。 4.1.1.6 溶血素：冻干品，使用前用蒸馏水溶解至规定容积。实验用水应符合GB/T6682要求。 4.1.1.7 阿氏液：见附录C。 4.1.1.8 稀释液：巴比妥缓冲液见附录C。 4.1.2预备试验（溶血素、补体、抗原等效价测定） 4.1.2.1溶血素效价测定（通常一个月左右测定一次） 4.1.2.1.1溶血素的稀释 先将溶血素稀释成1：100的基础液（如：溶血素以石炭酸防腐时，取0.1mL加9.9mL稀释液，如 以甘油为保存液，则取0.2ml加9.8mL稀释液，混合均匀），再按表1进一步稀释。 I SN/T1694—2011 表1 溶血素稀释法 稀释倍数(1：×) 要素 mL 500 1 000 1 500 2 000 2 500 3 000 3 500 4 000 5 000 1:100溶血素 0, 2 0. 1 0. 1 0. 1 0.1 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 稀释液 0. 8 0. 9 1. 4 1. 9 2. 4 2. 9 3. 4 3. 9 4. 9 全量 1. 0 1. 0 1. 5 2. 0 2.5 3. 0 3. 5 4. 0 5. 0 4.1.2.1.2 ：溶血素效价测定 按表2测定溶血索效价。 表2 2溶血素效价测定法（总体积125μL） 稀释倍数(1：X） 对照 要素 1 : 500 μL 500 1 000 1 500 2000 2 500 3000 3 500 4 000 5 000 补体 红细胞 溶血素 稀释的溶血素 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 稀释液 50 50 50 50 50 50 50 50 50 75 75 100 1:20补体 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 2.5%红细胞悬液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 温育 37℃水浴30min 按表2操作结束后，取出微量反应板，对照不出现溶血现象。微量反应板轻微振动混匀后，540nm 读取OD值，与标准比色孔（见附录D)比较，观察溶血度，记录结果。 4.1.2.1.3溶血素效价确定 能使25μL的2.5%红细胞悬液在37℃水浴箱内30min出现完全溶血（100%）的最小溶血素量， 称为一个溶血素单位，或溶血素效价。测定补体、抗原和做正式试验时，溶血索的用量为2个溶血素单 位或工作量。 4.1.2.1.4制备致敏红细胞悬液 按测定的溶血素效价稀释溶血素至2个标准单位，缓慢加人到等量的2.5%绵羊红细胞悬浮液中， 混合均匀，置37℃水浴箱中温育20min，即制备成致敏红细胞悬液。 4.1.2.2补体效价测定 每次进行补体结合反应试验，应于当日测定补体效价。先用稀释液，将补体做1：20稀释，然后按 表3进行操作。 2 SN/T16942011 表3补体效价测定（总体积125μL） 要素 孔 号 对照 μL 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1:20补体 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 稀释液 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 50 补加稀释液 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 温育 37℃水浴30min 致敏红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 温育 37℃水浴30min 按表3操作结束后，取出微量反应板，对照不出现溶血现象。行 微量反应板轻微振动混匀后，540nm 读取OD值，与标准比色孔（见附录D)比较，确定出现50%溶血时补体的最高稀释倍数为补体的效价， 即该浓度为此反应体系下1个补体溶血单位（CHso）。正式试验补体工作浓度为5个CHso。 4.1.2.3抗原效价的测定 按表4进行抗原效价的测定。 表 4 抗原效价测定（总体积125μL） 抗原稀释倍数 对照 要素 μL 1 : 10 1 : 50 1 : 75 1 : 100 1 : 150 1 : 200 1:300 1: 400 1 : 500 1 : 10 稀释的抗原 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 稀释的阳性血清 25 25 25 25 25 25 25 25 25 37℃水浴30min 5CHso补体 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 稀释液 25 - - 温育 37℃水浴30min 致敏红细胞 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 温育 37℃水浴30min 注：每一血清稀释度（1：5,1：10,1：25，1：50，1：75，1：100)各做一行，共计6行。 按表4操作结束后，取出微量反应板，对照不出现溶血现象。微量反应板轻微振动混匀后，540nm 读取OD值，与标准比色孔（见附录D)比较，观察溶血度，记录结果。 抗原效价的确定：在对照成立时，与阳性血清各稀释度发生抑制溶血最强的抗原最高稀释度为抗原 效价，即为1个单位抗原，正式试验抗原使用2个单位，即为该抗原的工作浓度。 4.1.3正式试验 4.1.3.1要素准备 按4.1.2的测定结果对各要素作稀释。 被检血清：按附录B制备。 3 SN/T1694—2011 工作抗原：按测定的效价稀释成工作浓度（2单位抗原），用25uL。 工作补体：按测定的效价稀释成工作浓度（5CHso），用25μL。 致敏红细胞悬液（见4.1.2.1.4)：每孔加50μL。 马疫阳性血清：1：5稀释，58℃灭活30min后，用25μL。 马疫阴性血清：1：5稀释，58℃灭活30min后，用25μL。 4.1.3.2血清效价测定 按表5的程序实施血清效价测定。 表5血清效价测定（总体积125μL） 补体对照 血清抗 要素 血清试验孔 补付 抗原 红细胞 μL 对照 2 1 对照 对照 CHso CHso 80 1 : × 5 10 20 40 160 320 25 25 血清 25 25 25 25 25 725 25 25 25 25 25 2单位抗原 25 25 一 一 稀释液 25 25 50 62.5 75 - 37℃水浴30min 5CHso补体 25 25 25 25 25 25 25 25 25 25 12.5 温育 37C水浴30mim 致敏红细胞 50 50 50/ 50 50 50 50 50 50 50 50 温育 37℃水浴3Qmin 4.1.3.3 结果判定 按表5操作结束后，取出微量反应板，轻微振动混匀后，40nm读取OD值，比照标准比色孔（附录 D)判读，各对照的结果如下时，可判定被检血清孔；否则，补体的效价应重新测定，并重做正式试验。 2个单位补体对照：100%溶血。 1个单位补体对照：50%溶血。 0个单位补体对照：不溶血。 抗原对照：100%溶血。 红细胞对照：完全不溶血。 阴性血清对照，完全溶血。 阳性血清对照，完全不溶血。 血清抗补体对照：抗补体对照孔应为100%溶血。如果抗补体对照孔与试验孔的抑制溶血程度相 同说明该血清为抗补体，血清抗补体可重新采样或用其他方法检测。 结果判定：被检血清1：.5稀释，抑制溶血≥50%判为阳性：抑制溶血在25%～50%之间判为可疑： 溶血程度在75%～100%溶血判为阴性。达到50%抑制溶血或以上时血清的最高稀释度为该血清的 效价。 4 SN/T1694—2011 4.2间接荧光抗体试验 4.2.1试验材料 4.2.1.1马嫌疫标准抗原、标准阳性血清、标准阴性血清、FITC荧光素标记的羊抗马免疫球蛋白，按 说明书使用。 4.2.1.