SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T21242013 代替SN/T2124—2008 大西洋三代虫病检疫技术规范 Quarantineprotocol for infection with Gyrodactylus salaris 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T2124-2013 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参考了世界动物卫生组织（OIE)的《水生动物疾病诊断手册（2011版）》中2.3.03大西洋鲑 三代虫病的有关章节，并结合了国内外的文献资料报道以及起草单位多年的检疫工作经验， 本标准代替SN/T2124一2008《大西洋鲑鱼三代虫检疫技术规范》。 本标准与SN/T2124--2008相比，主要技术变化如下： 简化了形态学鉴定方法，不再将其作为种类判定的主要依据； 一删除了IGS序列PCR鉴定方法； —一增加大西洋鲑三代虫结构图，标注其后吸器的结构，增加虫体消化及基于钩镰的种类鉴定 方法。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共 和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴绍强、林祥梅、刘、王彩霞、吕继洲、岳志芹、刘建、王建峰、张永宁、贾广乐、 张晏、邓俊花。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： SN/T2124—2008。 - 1 SN/T2124—2013 大西洋鲜三代虫病检疫技术规范 1范围 本标准规定了大西洋鲑三代虫病检疫时的样品采集、形态学检查、聚合酶链反应（PCR)初筛以及种 类鉴定方法。 本标准适用于大西洋鲑三代虫病的检疫以及流行病学调查。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出入境动物检疫采样 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ITS：扩增内部转录间隔区（internaltranscribedspacer） COI：线粒体细胞色素氧化酶I基因（mitochondrialcytochromeCoxidaseI） 4病原概述 4 大西洋鲑三代虫（Gyrodactylussalaris)是引起大西洋鲑三代虫病的一种淡水胎生寄生虫。从形态 上看，大西洋鲑三代虫与同属三代虫G.teuchis（主要寄生于褐鳟、大西洋鲑和虹）和G.thymalli（主 要寄生于河鳟)十分相似，容易彼此混淆，具体情况参见附录A。 5材料 除另有规定外，所用化学试剂均为分析纯。试验用水要求达到GB/T6682中一级水的要求。 5.1苦味酸铵-甘油（APG)溶液：配制方法见附录B的B.1。 5.2软组织消化液、消化终止液：配制方法见B.2、B.3。 5.3 裂解液：配制方法见B.4。 5.4引物：浓度为10μmol/L，其序列如下： ITS-up:5'-TTTCCGTAGGTGAACCT-3" ITS-1p:5'-TCCTCCGCTTAGTGATA-3" COI-up:5'-TAATCGGCGGGTTCGGTAA-3" COI-lp:5'-GAACCATGTATCGTGTAGCA-3" 5.5 5PCR缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、DNAMarker、电泳上样缓冲液等，均为商品化试剂盒中成分。 5.6 5电泳缓冲液：配制方法见B.5。 SN/T 2124-2013 5.795%乙醇。 5.8琼脂糖。 6设备 6.1解剖镜。 6.2生物显微镜。 6.3通风操作台。 6.4PCR仪。 6.5电泳仪。 6.6 凝胶成像仪或紫外透射仪。 7症状 鱼体表寄生一条至数十条大西洋鲑三代虫时多无临床症状表现。中度以上感染时，由于鱼在其他 物质表面摩擦皮肤导致体表有闪光点。后期由于体表渗出附着黏液而体表灰白，鳍.特别是腹部、尾部 及胸部的鳍出现坏死。严重感染的鱼，多在静水处不愿活动 大西洋鲑三代虫病症状缺乏典型特征，不作为疫病判定依据， 3大西洋鲑三代虫形态学检查 8 8.1采样及固定 符合GB/T18088的规定。 严重感染时.刮取鲑体表或鳍部位的坏死组织涂片镜检，可发现大量大西洋鲑三代虫。种类鉴定需 要在实验室内结合镜检及PCR进行 在实验室中检查大西洋鲑三代虫时，应采集活鱼并放在原生活的水中运输.且一个容器只装运一种 鱼。# 在冰中运输的死鱼不适宜作为大西洋鲑三代虫的检查样品 如没有对活鱼进行现场检查条件：宰杀后立即将整鱼置于95%乙醇中固定保存（鱼和95%乙醇比 例不超过1：9）。标本瓶应有足够大空间，同时瓶口足够开阔，以防放人、取出鱼时将虫体碰掉。瓶子 应水平放置.以利于鱼体舒展至鱼体完全固定为止，镜下观察时可借助镊子翻转鱼体。固定好后.将瓶 子竖直放置。 在鱼体较大或运输不方便时，也可采取鳍置于乙醇中保存送样。 8.2 活鱼的检查 采用针刺鱼脑杀死鱼。将鱼放在盛有运输时所用水的容器中，水完全没鱼体；采用双筒解剖镜对 活鱼逐条检查。检查时.避免鱼体表受折射光线的干扰；当采用上光源解剖镜进行检查时，容器底部宜 为黑色，增加反差便于寄生虫的监测。 检查整个鱼体表、特别是鱼鳍部位，使用2把镊子检查鳃和口腔、鼻腔。当检查体长大于10cm、没 有被固定的小鱼鳍条时.采用下光源解剖镜，容易观察到鳍条上的大西洋鲑三代虫。 8.3 固定的鱼标本的检查 采用上光源解剖镜对乙醇保存的鱼或鳍进行检查。 检查前需经自来水漂洗.将装有鱼的容器接在自来水水龙头下，让水流轻轻通过容器浸泡约2h。 2 SN/T2124—2013 冲洗前应检查保存液和容器底部的沉淀物中是否有大西洋鲑三代虫。 也可直接取乙醇保存的鱼或者鱼鳍进行镜检。检查时，可佩戴手套，将解镜放在具有下出风口的 通风操作台上进行。 8.4虫体标本制作和形态观察 8.4.1操作步骤 8.4.1.1加一滴水到载玻片上，然后将待检虫体放到水滴上，盖上盖玻片，用一块滤纸在盖玻片的边缘 慢慢吸水，直到水基本吸干为止。 8.4.1.2滴一小滴苦味酸铵-甘油（APG，见B.1)溶液到盖玻片的边缘，使其浸满盖玻片与载玻片之间 的空隙。 8.4.1.3 3在玻片上做好标签，标签上注明宿主种类，虫体的寄生部位、采集地点、采集日期和水温。 8.4.1.4 用生物显微镜观察玻片中的虫体 8.4.2形态特征 为便于种类鉴定，宜用活的虫体制作标本。甲醛固定的鱼，大西洋鲑三代虫标本呈白色；而乙醇固 定的鱼，大西洋鲑三代虫则呈轻微的灰暗颜色 大西洋鲑三代虫属寄生虫体小而延伸.体长0.7mm1.0mm后吸器有1对中央大钩及背联结 片与腹联结片各一，16个边缘小钩（参见附录C的图C.1）其种类鉴定的依据是后吸器（即固着器）上 边缘小钩、锚钩和联结棒的形态和大小（参见图C.2） 在进行种类鉴定时需采用软组织消化液（见B.2）对虫体进行消化处理，只剩下硬的部位检查。消 化步骤可在显微镜下进行，当观察到软组织消化完全后，加人终止液（见B.3）。 大西洋鲑三代虫在形态上与褐、太西洋鲑和虹鲟身上的G.teuchis以及河鳟身上的G.thymalli 十分相似。但G.teuchis的钩镰要长而且更弯，G.thymalli的镰杆的角度要小一些。后吸器各部件形 态虽相对较为固定，但大小差异较大，故大小不足作为种类鉴定依据。 9PCR检测及鉴定 9.1样品制备 采用从新鲜鱼体表采集的可疑虫。用乙醇保存的样品，去掉多余的乙醇。 将虫体放在0.5mL的离心管里。加大75裂解液（见B.4)，65℃作用20min，再95℃加热 10min。该裂解产品不需要进一步纯化就可以用作为PCR模板。除检测样品外，还应设立以下对照： 一一取已知大西洋鲑三代虫样品作为阳性对照； 取健康鱼组织样品作为阴性对照。 9.2大西洋鲑三代虫ITS序列PCR检测方法 9.2.1反应体系 在PCR管内加人10×缓冲液（含Mg2+）2.5μL，dNTP（各2.5mmol/L)2.5μL，ITS-up0.5μL， ITS-lp0.5μL，rTaq(5U/μl)0.5μL模板DNA2μLddH,O将反应体系补充至25μL。 9.2.2反应程序 95℃预变性5min；95℃，1min；55℃1min；72℃，2min；35个循环；72℃，延伸7min。 3