ICS 67.060 B 20 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3556—2020 粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋 氨酸的测定 液相色谱一电感耦合 等离子体质谱法 Determination of selenocysteine and selenomethionine in cereals- Liquid chromatography-inductively coupled plasma mass spectrometry 2020-03-20 发布 2020-07-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3556—2020 本标准由农业农村部种植业管理司提出并归部 本标准起草单位：中国水稻研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所、中国科学院沈 阳应用生态研究所、国家农业检测基准实验室（重金属）。 本标准主要起草人：曹赵云、毛雪飞、王世成、牟仁祥、贾垚、刘雯欣、许萍、李波、章林平、李金秋、王莹、 王颜红、陈铭学、朱智伟。 I. NY/T3556—2020 粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法 1范围 本标准规定了粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的液相色谱-电感耦合等离子体质谱测定法的原理， 规定了其试剂和材料、仪器和设备、试样制备、分析步骤、结果计算和精密度。 本标准适用于稻米、小麦、玉米、高粱、小米中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量的测定。 本标准中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的方法定量限均 均为0. 05mg/kg 2规范性引用文件 少 用文 注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用文件，其最新片 分析实验室用水规格和试！ RESE GB/T6682 3原理 S 试样中硒亻 胱氨酸和硒代蛋氨酸用蛋白酶 租 离子对液 电感耦合等离子 体质谱仪测定 乐法定量 R 4试剂和材料 以下所用试剂 除特殊 明外 二级 4.1 盐酸(HC 4.2 三羟甲基 甲烷 4.3乙酸铵(CH 4.4四丁基氢氧 H 乙酸(CH:CO 画谱 4.6甲醇(CH:OH) 4.7蛋白酶（proteaseXIV型）：酶活力 每分钟水解酪蛋白产生 不少于3.5μmol酪氨酸）。 4.8三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI)缓冲液(30mmol/L，pH7.5)：称取1.817g三羟甲基氨基甲烷 （4.2)溶于约450mL水中，用盐酸（4.1)调节pH至7.5.加水稀释至500mL，摇匀，备用。 4.9流动相（15mmol/L乙酸铵，0.2mmol/L四丁 基氢氧化铵，5%甲醇，pH5.5）：称取1.156g乙酸铵 （4.3)溶于900mL水中，加人0.2mL四丁基氢氧化铵（4.4），用乙酸（4.5)调节pH至5.5，加入50mL 甲醇（4.6），加水稀释至1000mL，摇匀，于水浴中超声脱气10min，备用。 4.10标准品 4.10.1硒代半胱氨酸（C:HNO2Se，CAS号：10236-58-5），纯度≥95%。 4.10.2硒代蛋氨酸（CsHNO2Se，CAS号：9001-05-2)，纯度≥98%。 4.11标准溶液 4.11.1硒代半胱氨酸标准储备液（1000mg/L，按Se计）：称取21.2mg硒代半胱氨酸标准品 （4.10.1），用水溶解并定容至10mL。0℃～4℃避光保存，有效期3个月。 4.11.2硒代蛋氨酸标准储备液（1000mg/L，按Se计）：称取24.8mg硒代氨基酸标准品（4.10.2），用 1 NY/T3556—2020 水溶解并定容至10mL。0℃~4℃避光保存，有效期3个月。 4.11.3混合标准储备液（10.0mg/L)：分别准确吸取1.0mL硒代半胱氨酸标准储备液（4.11.1)和硒代 蛋氨酸标准储备液（4.11.2)于100mL容量瓶中，加水稀释并定容至刻度。0℃～4℃避光保存，有效期1 个月。 4.11.4混合标准使用液：用流动相（4.9)将混合标准储备液（4.11.3）逐级稀释成浓度为0.10μg/L、 0.50μg/L、1.0μg/L、2.0μg/L、5.0μg/L和10μg/L的混合标准使用液，现用现配。 4.11.5液氩或氩气：纯度≥99.99%。 4.11.6氢气：纯度≥99.999%。 5仪器和设备 5.1液相色谱电感耦合等离子体质谱仪：配碰撞反应池。 5.2分析天平：感量为0.1mg和0.01g。 5.3谷物粉碎机。 5.4恒温振荡器：振荡转速≥300r/min。 5.5超声波清洗器。 5.6离心机：转速≥5000r/min。 5.7涡旋混合器。 6试样制备 取代表性粮谷样品，用谷物粉碎机（5.3)粉碎，过425μm孔径的圆孔筛，混匀，装入洁净的盛样袋内， 备用。 7分析步骤 7.1试样提取 称取试样1g(精确至0.01g)于50mL离心管中，加人10mLTris-HCl缓冲液（4.8)，室温下于超声水浴 中超声30min。取出，加入25mg蛋白酶（4.7)，混匀，置于（37士2)℃恒温振荡器中（转速300r/min)振荡酶 解20h，取出，于5000r/min下离心10min。吸取2mL上清液至10mL容量瓶中，加流动相（4.9)稀释 至刻度，混匀，过0.22μm滤膜，待测。 7.2测定 7.2.1液相色谱电感耦合等离子体质谱参考条件 7.2. 1. 1 液相色谱条件 色谱柱：反相Cis色谱柱（4.6mmX250mm，5μm），或相当者； 流动相（pH5.5）：含15mmol/L乙酸铵、0.2mmol/L四丁基氢氧化铵、5%甲醇； 流动相流速：1.0mL/min； 柱温：30℃； e) 进样量：50μL。 7. 2. 1. 2 2电感耦合等离子体质谱条件 雾化器：同心雾化器； b) 雾化室温度：2℃； c) 炬管内径：2.5mm； 采样锥/截取锥（Ni)孔径：1.0/0.4mm； e) 采样深度：6.4mm； 采集质量数：78； 2 NY/T3556—2020 g）高频等离子体发射功率：1550W； 载气流量：1.02L/min； i) 载气补偿气流量：0.11L/min； 稀释气流量：0.34L/min； k） 等离子体气体流量：15L/min; 1）全 氢气流量：3.5mL/min； m）蠕动泵转速：0.3r/s； n） 积分时间：1.0s。 7.2.2标准曲线 取混合标准使用液（4.11.4），按浓度由低到高依次进样测定，以各硒形态色谱峰面积和浓度作图，绘 制标准曲线。混合标准溶液的色谱图参见附录A。 7.2.3试样溶液测定 取试样溶液进样测定，根据标准溶液的色谱保留时间定性，从标准曲线得到的样液中硒代半胱氨酸和 硒代蛋氨酸浓度。试样溶液中2种硒形态的响应值均应在标准曲线线性范围内；当试液超出线性范围时， 应用流动相（4.9)进行适当稀释后进样测定。标准溶液的色谱图参见附录A。 7.3空白试验 除不加试样外，按7.1和7.2步骤，随同试样进行空白试验。 8结果计算 试样中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量（以Se计)用质量分数w;计，单位以毫克每千克（mg/kg）表 示，按式（1)计算。 (c; -c。)×V W;= (1) mX1000 式中： w; 试样中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； Ci 样液中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸浓度，单位为微克每升（ug/L）； Co 空白试液中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸浓度，单位为微克每升（μg/L）； V 试液最终定容体积，单位为毫升（mL）； m 试样溶液所代表试样的质量，单位为克（g）； 1 000 换算系数。 计算结果结果保留2位有效数字。 9精密度 在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。 NY/T3556—2020 附录A （资料性附录） 硒混合标准溶液色谱图 硒混合标准溶液色谱图见图A.1。 Count 80000 60000 半胱氨酸： 基硒代半胱氨酸 蛋氨酸 酸 图A硒混合标准溶液色谱图 NY/T 3556-2020 品标 中华人 农业行业标准下 粮谷中硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的测定 液相色谱-电感耦合等离子体质谱法 NY/T3556—2020 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2020年6月第1版 2020年6月北京第1次印刷 书号：16109·8135 定价：18.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3556—2020 举报电话：（010）59194261