ICS 67.080.10 B 31 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3548—2020 水果中黄酮醇的测定 液相色谱一质谱联用法 Determination of flavonols in fruits-LC-MS-MS 2020-03-20发布 2020-07-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3548—2020 本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC501)归口。 本标准起草单位：中国农业科学院果树研究所、青岛农业大学、农业农村部果品及苗木质量监督检验 测试中心（兴城）。 本标准主要起草人：聂继云、李静、张海平、张建一、闫震、李银萍。 NY/T3548—2020 水果中黄酮醇的测定 液相色谱-质谱联用法 1范围 本标准规定了水果中黄酮醇含量测定的高效液相色谱-质谱联用法的原理、试剂和材料、仪器、试样的 制备、分析步骤、结果计算、精密度和色谱图。 本标准适用于水果中皮素、山奈酚 、异鼠李素、杨梅素丁香亭、落叶松亭6种黄酮醇的含量测定。 本标准黄酮醇的线性范围为0.2mg/L~20mg/L.杨梅素和异鼠李素的检出限为0.05mg/kg，定量 0.15mg/kg，定量限为0. 0mg/kg; ，定量限为 1.00mg/kg。 2规范性引用文件 下列文件对于本 本文件的应用是 可少的。凡是注日期的 用文 期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引 用文 件真最 新版本（包活所有的修改） GB/T6682 用水规格和式验方法 3原理 水果中的黄酮醇糖香 高效液相色谱柱分 测外标法定量 4试剂和材料 除非另有说明 4.1试剂 4.1.1硫酸(H 优级纯。 4.1.2甲酸(CH2 AS 4.1.3甲醇(CH,C 色谱 4.1.4乙腈(C²H3N, 号：75 色谱 屯 4.1.52%硫酸溶液：吸取 20.00mL硫酸移 盛有 水的容量瓶中 即后定容至1000.0mL。 4.1.6提取剂：甲醇十水 （=80+20(V+V），取800mL甲醇（4.1.3)和200 mL水混匀。 4.1.7流动相A：水十甲酸=995+ V)，取995mL水和5mL甲酸（4.1.2)混匀。 4.2标准品 6种黄酮醇标准品：纯度≥98%，相关信息见附录A。 4.3标准溶液配制 4.3.1黄酮醇标准储备液：分别称取皮素、山奈酚、异鼠李素、杨梅素、丁香亭和落叶松亭标准品20.00mg 用甲醇（4.1.3）溶解并定容至50mL，配制成400mg/L的标准储备液，一20℃保存，可使用12个月。 4.3.2黄酮醇混合标准溶液：根据需要，准确吸取一定量的各黄酮醇标准储备液，用甲醇（4.1.3)稀释成 适当浓度的混合标准溶液，现用现配。 4.4材料 4.4.1有机相微孔滤膜：0.22um。 4.4.2固相萃取小柱：反相C18固相萃取小柱，200mg/6mL，或性能相当者。 1 NY/T3548—2020 5仪器 5.1液相色谱仪：配有三重四级杆质谱检测器。 5.2电子天平：感量为0.01g和0.0001g。 5.3离心机：9000r/min以上。 5.4油浴锅：带磁力搅拌，温度可调节。 5.5超声波清洗器。 5.6旋转蒸发仪。 6试样的制备 取可食部分，切碎混匀，制成匀浆。 7分析步骤 7.1提取 称取10.00g试样于50mL棕色离心管中，加人约30mL提取剂（4.1.6)，混匀，室温下超声萃取20min， 骤重复提取一次，合并2次提取液，用提取剂（4.1.6)定容至50.0mL。 7.2黄酮醇糖苷的制备 7.2.1吸取20.00mL样品提取液（7.1)于250mL旋转蒸发瓶中，40℃下减压蒸发至近干，加人5mL 水，摇匀。 7.2.2依次用5mL甲醇（4.1.3)和约5mL水预淋洗、活化固相萃取小柱（4.4.2)。 用5mL水分2次清洗旋转瓶，转人固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液 7.2.4用10mL甲醇（4.1.3)分2次清洗旋转瓶，转人固相萃取小柱中，收集滤液于250mL旋转瓶中， 蒸干备用。 7.3黄酮醇的制备及净化 7.3.1在收集有提取物（7.2.4)的旋转瓶中加入20.0mL2%硫酸溶液（4.1.5)，并将其放入到150℃的 油浴锅（5.4)中，加热回流20min后取下冷却。 7.3.2依次用5mL甲醇（4.1.3)和约5mL水预淋洗、活化固相萃取小柱（4.4.2)。 7.3.3将7.3.1的溶液倒入固相萃取小柱中，缓慢抽滤（滤液呈滴状流出），弃去滤液。用10.00mL水 分2次清洗旋转瓶，转入固相萃取小柱中，抽滤，弃去滤液。 7.3.4用20mL甲醇（4.1.3)分4次清洗旋转瓶，转人固相萃取小柱中，收集并合并滤液于旋转瓶中， 40℃下减压蒸发近干，用甲醇（4.1.3)定容至4.00mL，混匀，过滤膜（4.4.1)，待测。 7.4试剂空白试验 除不加人样品外，其他过程与样品处理相同。 7.5测定 7.5.1液相色谱-串联质谱参考条件 色谱柱：反相Cis色谱柱，柱长150mm，内径2.1mm，颗粒度1.8μm，或性能类似色谱柱，并连接相 同填料保护柱。 流速：0.3mL/min。 流动相：A相为0.5%甲酸，B相为乙睛，流动相梯度洗脱程序见表1。 2 NY/T3548—2020 表1流动相梯度洗脱程序 时间，min 流动相A,% 流动相B,% 0.00 100 0 1. 00 80 20 2. 00 70 30 8. 00 55 48 8.20 20 80 9. 20 20 80 9.50 100 0 15.00 100 0 柱温：40℃。 进样量：2μL。 电离源模式：电喷雾离子化。 电离源极性：正离子模式。 雾化气：氮气。 碰撞气（高纯氩气）流速：0.13mL/min。 离子源温度：150℃。 脱溶剂气温度：500℃。 脱溶剂气流量：800L/h。 监测离子对、碰撞气能量和源内破碎电压参见附录B。 7.5.2定性测定 在相同试验条件下进行样品测定时，样品检出的色谱峰的保留时间与标准样品相一致，扣除背景后的 样品质谱图中所选离子均出现，而且所选的离子丰度比与标准样品的离子丰度比相一致（表2），则可判断 为该成分检出。试剂空白不应有对被测组分有干扰的物质检出。 表2质谱选择离子丰度允许偏差 单位为百分号 相对丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 允许偏差 ≤±20 ≤±25 7.5.3定量测定 标准采用外标-校准曲线法定量测定。保证所测样品中组分的响应值均在仪器的线性范围内。 8 结果计算 样品中待测组分的含量以质量分数计，以毫克每千克（mg/kg）表示，结果按式（1)计算 (1) mXV, 式中： X 试样中待测组分的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 标准曲线计算出试样提取溶液中各组分的浓度，单位为毫克每升（mg/L）； V 试样提取液定容体积，单位为毫升（mL）； V。- 净化后用于仪器测定的定容体积，单位为毫升（mL）； Vi 吸取用于制备黄酮醇的样品溶液体积，单位为毫升（mL）； m 所取试样的量，单位为克（g）。 计算结果保留到小数点后2位。 3 NY/T3548—2020 9精密度 在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。 在再现性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不得超过算术平均值的15% 10 色谱图 各目标化合物的多反应监测(MRM)色谱图参见图C.1。 NY/T3548—2020 附 录 A （规范性附录） 各目标化合物的标准物质基本信息 各目标化合物的标准物质基本信息见表A.1。 表A.1 各目标化合物的标准物质基本信息 名称 CAS号 英文 分子式 相对分子量 杨梅素 529-44-2 Myricetin Cis Hio Os 318. 25 榭皮素 117-39-5 Quercetin Cis Hio O, 302. 24 落叶松亭 53472-37-0 Laricitrin Cie Hi2 O8 332.27 丁香亭 4423-37-4 Syringetin Ci, Hi, Os 346.29 山奈酚 520-18-3 Kaempferol Cis HloOs 286.25 异鼠李素 480-19-3 Isorhamnetin Cls Hi2 O7 316.28 5