ICS65.020 B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3494—2019 农业生物质原料 纤维素、半纤维素、 木质素测定 Agricultural biomass raw materials-Determination of cellulose,hemicellulose,and lignin 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3494—2019 准 平 前 /言 农 国 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起奠。 公 本标准由农业农村部科技教育司提出并归口。 本标准起草单位：中国农业大学。 本标准主要起草人：韩鲁佳、肖卫华、刘贤、杨增玲、黄光群。 NY/T3494—2019 农业生物质原料 纤维素、半纤维素、 木质素测定 1范围 本标准规定了农业生物质原料中纤维素和半纤维素含量测定的高效液相色谱方法，以及木质素含量 测定的紫外分光光度方法和重量方法。 本标准适用于农作物秸秆纤维素、半纤维素及木质素的测定 2规范性引用文件 PUBL GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 Q NY/T3492 农业生物质原料 样品制备 3试剂和材料 S 除非另有说明， 所有试剂 剂巧均为分析纯的试剂色谱用水为GBT6682规定 其他使用三级水。 3.1乙醇：95 又665mL硫酸（98%缓缓注大300mL水） 中冷却， 3.3碳酸钙 3.4D-纤维 糖 D王）葡萄糖DC木糖、DC+）半乳糖、L(阿拉伯糖D 土露糖标准品：纯度》 95%。 CENTE CUI 4 仪器和设备 4.1 分析天平：感量 4. 2 索氏抽提器 4.3 电热鼓风干燥 5+3 4. 4 恒温水浴锅：温度可控制在（30 4.5 高压蒸汽灭菌器：温度可控制在 4.6 马弗炉：可程序升温，温度可控制在（57 5° 4.7 耐压试管：螺纹具塞，耐压≥60p 4.8 真空过滤器：配玻璃砂芯埚（G4）。 4.9高效液相色谱仪：配示差折光检测器 4.10 紫外-可见分光光度计：可在320nm处测定吸光值。 4.11 微孔过滤器：带0.22μm水相微孔滤膜。 5分析步骤 5.1 试样制备 按照NY/T3492的规定执行。 5.2抽提 5.2.1水抽提 NY/T 3494—2019 称取2g10g试样（精确至0.1mg)于已称重的滤纸筒中，将滤纸筒放入索氏抽提器的抽提筒内，连 接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加人190mL水，于电热套上加热，使水不断回流抽提（4 次/h～5次/h），一般抽提6h～8h。抽提完成后，关闭加热套，将索氏抽提器冷却至室温。 5.2.2乙醇抽提 将5.2.1水抽提后的抽提筒连接已干燥至恒重的接收瓶，由抽提器冷凝管上端加人190mL乙醇，于 电热套上加热，使乙醇不断回流抽提（6次/h～10次/h），一般抽提16h～24h。抽提完成后，关闭加热套， 将索氏抽提器冷却至室温。经两步抽提后的生物质试样（即不含抽提物试样)在（45士3)℃干燥箱中干燥 至恒重,称量试样质量精确至 0. 1 mg。 5.3两步法酸水解 5.3.1埚恒重 将玻璃砂芯(G4)置于马弗炉中，在(575士25)℃下灼烧至恒重。将埚从马弗炉中取出后放入 干燥器冷却，称量埚质量精确至0.1mg。 5.3.2浓酸水解 称取300.0mg(精确至0.1mg)不含抽提物试样至耐压试管，每个试样做2次以上平行实验。向耐 压试管中加人3.00mL72%硫酸溶液后立即混合均匀，将耐压试管放人（30士3)℃水浴中，5min～10 min搅拌一次。恒温60min后取出，向耐压试管中加人84.00mL水，拧紧盖子混合均匀。 5.3.3糖的回收率 用于计算回收率的糖标准溶液称为糖回收标准溶液，包括D(十)葡萄糖、D(十)木糖、D(十)半乳糖、L (十)阿拉伯糖、D(十)甘露糖。糖回收标准溶液的糖浓度应该与检测试样的糖浓度接近。称量每种糖的 质量精确至0.1mg，放人耐压试管中，加人10.0mL水，再加人348μL72%硫酸溶液，拧紧盖子混匀。用 微孔过滤器过滤，分装于样品瓶中，冷冻储藏，使用时取出解冻并摇匀。 5.3.4稀酸水解 至室温后，通过玻璃砂芯埚（G4)过滤，用锥形瓶收集滤液约50mL，转移至具塞容器0℃～4℃储藏，于 24h内进行纤维素和半纤维素测定，6h内进行酸溶木质素的测定。 5.4测定 5.4.1酸溶木质素 使用5.3.4酸水解溶液，用紫外-可见分光光度计在320nm处测量液体试样的吸光值。用水作紫外- 可见分光光度计空白，用水稀释试样至吸光值为0.7～1.0，记录稀释倍数，记录吸光值精确到0.001。 5.4.2酸不溶木质素 5.4.2.1用大于50mL的热水冲洗100mL具塞耐压试管中残留的酸不溶残渣，使残渣全部保留在玻璃 录玻璃砂芯(G4)和酸不溶残渣质量，精确到0.1mg。 5.4.2.2将玻璃砂芯埚(G4)及酸不溶残渣置于马弗炉中（575土25)℃灼烧至少3h，直至所有有机物 被灰化。升温速率控制在10℃/min，以防止试样燃烧以及强气流引起的试样机械损失。灰化结束后降温 至105℃，取出放人干燥器中冷却。称量埚和灰分质量精确到0.1mg。 5.4.3碳水化合物 5.4.3.1色谱条件 色谱柱：聚苯乙烯二乙烯苯树脂铅型糖分析柱，配备相应除灰保护柱。 流动相：水。 流速:0.6mL/min。 柱温：80℃~85℃。 进样量：20uL。 检测器：示差折光检测器，检测器温度尽可能接近柱温箱温度。 2 NY/T3494—2019 5.4.3.2标准曲线的绘制 参照表1中建议的浓度范围准备D-纤维二糖、D(十）葡萄糖、D(十)木糖、D(十）半乳糖、L（十）阿 拉伯糖、D十）甘露糖的混合标准溶液，使用四点校正法。分别吸取20uL标准溶液注人高效液相色谱 仪，在5.4.3.1色谱条件下测定标准溶液的响应值（峰面积），以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制 标准曲线。 表1糖标准溶液的建议质量浓度范围 组分 建议质量浓度范围，mg/mL D-纤维二糖 0.1~4. 0 D(+)葡萄糖 0.1~4.0 D(+)木糖 0.1~4. 0 D(+)半乳糖 0.1~4. 0 L(+)阿拉伯糖 0.1~4. 0 D(+)甘露糖 0. 1~4. 0 5.4.3.3试样溶液测定 取20mL5.3.4酸水解液体到50mL锥形瓶中，缓慢加入碳酸钙将水解液中和至pH5~6。待试样 沉淀后轻轻倒出上清液。将上清液用微孔过滤后进行高效液相色谱分析。由标准曲线回归方程计算试样 中的D(十)葡萄糖、D(+)木糖、D(+)半乳糖、L(十)阿拉伯糖和D(+)甘露糖含量。 注：检测试样中纤维二糖的含量高于3mg/mL说明水解作用不完全。在纤维二糖之前有峰存在，表明试样中糖发生 了过度水解。 6结果计算 6.1酸溶木质素含量 试样中的酸溶木质素含量ASL，以质量百分数（%)表示，按式(1)计算。 AXVXNXwXL ASL =- (1) Wef XW。Xe 式中: ASL 试样中的酸溶木质素含量，单位为质量百分数（%）； A 滤液在320nm处的紫外-可见吸光值平均值（5.4.1)； V 滤液（5.3.4)体积，取值为87mL； N 滤液稀释倍数； L 比色血厚度，单位为厘米（cm）； 酸溶木质素在320nm处吸收率，玉米秸秆取30L/（g·cm），其他原料取25L/（g·cm）； om -5.2.1抽提前试样的质量，单位为克（g）； W1 -5.2.2抽提后试样的质量，单位为克（g）； Wef -5.3.2称取的不含抽提物试样质量，单位为克（g）。 6.2酸不溶木质素含量 试样中的酸不溶木质素含量AIL，以质量百分数（%)表示，按式(2)计算。 AIL: omXm 式中： AIL- 试样中酸不溶木质素含量，单位为质量百分数（%）； m1 玻璃砂芯埚（G4)质量（5.3.1)，单位为克（g）； m2 玻璃砂芯埚(G4)和酸不溶残渣（5.4.2.1)的质量，单位为克（g）； m3 玻璃砂芯埚(G4)和灰分(5.4.2.2)的质量，单位为克（g）。 3 NY/T3494—2019 6.3木质素含量 试样中的总木质素含量Lig，以质量百分数（%）表示，按式（3)计算。 Lig=ASL+AIL (3) 式中： Lig 试样中总木质素含量，单位为质量百分数（%）： ASL一试样的酸溶木质素含量，单位为质量百分数（%）； AIL一试样的酸不溶木质素含量，单位为质量百分数（%）。 6.4纤维素和半纤维素含量 6.4.1糖回收率 D-纤维二糖、D(+)葡萄糖、D(+)木糖、D(+)半乳糖、L(+)阿拉伯糖、D(十)甘露糖的回收率R;以 质量百分数（%）表示，按式（4)计算 :(4) 式中： Cil 酸水解后（5 3）测得第 Cio 酸水解前（ 3.3)第 种单糖的质量浓度，单位为毫 克每享 6.4.2纤维素和半经 m 6.4.2.1试样 中的有 葡聚粉、 聚糖、半乳聚糖阿拉伯聚糖甘露聚糖的含 货量百分数（%）表示， 按式(5)计算 .(5) 式中： 高效液 法测定试样中的第种单糖[D 葡萄糖 乳糖、L(+)阿 Ci 拉伯 F 脱水 拉伯聚糖用0.88的脱 半乳 L聚糖和甘露聚糖用 0.9 校 6.4.2.2试样中 素含 量百分数（表示 (6) 式中： Cel 一试样中纤维素含量 单位为质量百分数（ Z1 试样中葡萄聚糖的含量，单位为质量百分数（ 6.4.2.3 试样中半纤维素含量Hem，以质量百分数（%）表示：按式（7)计拿 Hem 2+Z3 +Z5 (7) 式中： Hem 试样中半纤维素含