ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3479—2019 饲料中氢溴酸常山酮的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of halofuginone hydrobromide in feeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry 2019-08-01发布 2019-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3479—2019 前 VD 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起算。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本标准起草单位：辽宁省兽药饲料畜产品质量安全检测中心。 本标准主要起草人：王丽娜、田晓玲、刘凯、张明、张秀芹、李欣南、李永才、刘笑、陈玉艳、张天姝。 I NY/T3479—2019 饲料中氢溴酸常山酮的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中氢溴酸常山酮含量测定的液相色谱-串联质谱法。 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中氢溴酸常山酮的测定。 本标准的检出限为25μg/kg，定量限为50ug/kg。 2规范性引用文件 Q GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T20195 动物饲料√试样的制备 人 3原理 S 试样用乙睛提取， 经过除脂净化后用液相色谱串联质谱法测定：内标法定量 4试剂或材料 除非另有规定 本方法仅用分析纯试剂。 4.1水：GB/T6682 人级 4.2乙腈：色谱纯 CENTE 4.3甲醇：色谱纯 4.4正已烷。 C 4.550%甲醇溶液 量取甲醇50ml 加水至 100mL,混勺 4.60.1%甲酸溶液 999mL水，混勺 氢溴酸常山酮储 924-67-0，纯度≥ 刻度，摇匀。2℃~ 8℃下保存，有效期为3个月 4.8氢溴酸常山酮-13Cc内标储备溶液（200mg/mL）：准确称取氢溴酸常山酮 C.内标标准品10mg（精 确至0.00001g），至50mL容量瓶中，用50%甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀。2℃～8℃下保存，有效 期为3个月。 4.9氢溴酸常山酮标准中间溶液（10μg/mL)：准确吸取5mL的标准储备溶液（4.7)，至100mL容量瓶 中，用50%甲醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀。临用现配。 液（4.8），至50mL容量瓶中，用50%甲醇溶液稀释并定容至刻度，摇匀。临用现配。 4.11标准曲线的配制：准确吸取氢溴酸常山酮标准中间溶液（4.9)和内标中间溶液（4.10)适量，用50% 甲醇溶液（4.5）稀释配制成氢溴酸常山酮浓度为20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL 的标准工作溶液，内标浓度均为50ng/mL。临用现配。 4.12微孔滤膜：孔径0.22μm，有机相。 5仪器设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。 1 NY/T 3479—2019 5.2天平：感量0.00001g和感量0.001g。 5.3离心机：转速不低于10000 r/min。 5.4涡旋仪。 5.5氮吹仪。 6样品 按照GB/T20195的规定制备样品，粉碎后过0.42mm孔径的样品筛，混匀，装入磨口瓶中，备用。 7 试验步骤 7.1提取 平行做2份试验。称取试样2g(准确至0.001g)于50mL离心管中，准确加人内标中间溶液（4.10) 100μL，加人乙腈（4.2)20mL，涡旋60s，于10000r/min离心5min，将全部上清液转移至另一离心管 中，加入5mL正已烷（4.4），涡旋30s，于10000r/min离心5min。弃去上层溶液，将下层溶液50℃氮气 吹干，准确加人50%甲醇（4.5)溶液2mL溶解后，再加人5mL正已烷（4.4），涡旋30s，10000r/min离 心5min。弃去上层溶液，取下层溶液过0.22um滤膜过滤，上机测定。 7.2 测定 7.2.1液相色谱参考条件 色谱柱：C18，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7μum，或其他性能相当者。 柱温：40℃。 进样量：10μL。 流速：0.3mL/min。 流动相：A为甲醇（4.3）；B为0.1%甲酸水溶液（4.6),梯度洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 时间，min A,% B,% 0.00 5 95 1. 00 5 95 3. 00 95 5 3. 50 95 5 5.00 5 95 7.2.2质谱参考条件 离子源：电喷雾离子源。 监测方式：多反应监测。 扫描方式：正离子扫描。 电离电压：3.2kV。 离子源温度：120℃。 雾化气温度：350℃。 锥孔气流速：50L/h。 雾化气流速：650L/h。 药物定性定量离子对、碰撞能量见表2。 表2定性定量离子对、碰撞能量 被测物名称 定性离子对,m/z 定量离子对，m/z 碰撞能量，eV 414.0>119.5 20 氢溴酸常山酮 414.0>138.2 414.0>138.2 20 氢溴酸常山酮-13Cs内标 420.0>138.2 420.0>138.2 20 2 NY/T 3479—2019 7.3定性测定 在相同的试验条件下，试样中待测物的保留时间与标准工作溶液的保留时间偏差在士2.5%之内，且 试样谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子相对离子丰度 进行比较，若偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在对应的待测物。 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 单位为百分率 相对离子丰度 >50 20～50(含) 10~20(含） ≤10 允许最大偏差 ±20 ±25 ± 30 ±50 7.4定量测定 取试样溶液（7.1)和相应浓度的标准工作溶液（4.11)上机测定，得到色谱峰面积响应值。以氢溴酸常 山酮峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标、浓度比为横坐标，绘制标准曲线。曲线相关系数不低于0.99。 做单点或多点校准，以色谱峰面积比值定量。当待测物浓度高于线性范围内时，重新称取样品加人适量内 标，处理，稀释后测定。氢溴酸常山酮标准品及内标物质量色谱图参见附录A。 8试验数据处理 饲料中氢溴酸常山酮含量以质量分数w计，数值以微克每千克（μg/kg)表示，按式(1)计算。 AXA" XC, XC, XV = :(1) Ais XA, XCis Xm 式中: A 一一试样溶液中氢溴酸常山酮峰面积； A'i——标准工作溶液中氢溴酸常山酮内标物峰面积; C. 一 -标准工作溶液中氢溴酸常山酮浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Cis 试样中内标物浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； -溶解残余物所用溶液体积，单位为毫升（mL）； Ais- 一试样溶液中内标物峰面积； A- 标准工作溶液中氢溴酸常山酮峰面积； Cis——标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)； m 试样的质量，单位为克（g）。 测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。 9精密度 在重复性条件下获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不得超过其算术平均值的 20%。 3 NY/T3479—2019 附录A （资料性附录） 氢溴酸常山酮标准品及内标物质量色谱图 氢溴酸常山酮标准品及内标物质量色谱图分别见图A.1、图A.2、图A.3。 % 4.16 14>138.24 (HHB) 100 5.53e3 PUBLI 0 3.00 常山酮标准品定 (50ug/ 图A. 氢溴酸 1.00 2.00 3.00 1.00 氢溴酸常山酮标准品定性离子质量色谱图（50g/L （50ug/L) R NY/T 3479-2019 平台 农业行业标准 饲料中氢溴酸常山酮的测定 液相色谱-串联质谱法 NY/T3479—2019 * * * 中国农业出版社出版 (北京市朝阳区麦子店街18号楼) （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mmX1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2019年10月第1版 2019年10月北京第1次印刷 书号：16109·4844 定价：18.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3479—2019 举报电话：（010）59194261