(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211274132.4 (22)申请日 2022.10.18 (71)申请人 浙江大学 地址 310058 浙江省杭州市西湖区余杭塘 路866号 (72)发明人 潘远江　周世文　冯鸿儒　 (74)专利代理 机构 杭州求是专利事务所有限公 司 33200 专利代理师 陈升华 (51)Int.Cl. C12Q 1/6869(2018.01) G01N 27/64(2006.01) G01N 1/28(2006.01) G01N 1/36(2006.01) (54)发明名称 二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在 寡核苷酸测序中的应用 (57)摘要 本发明公开了TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料作为 MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。 合成的 TiO2/ZnAl‑LDO材料兼有高紫外光吸收性能和电 荷传导性能， 在对寡核苷酸序列的测定中， 水或 甲醇作为TiO2/ZnAl‑LDO纳米颗粒的溶剂在激光 的诱导下在TiO2/ZnAl‑LDO表面生成羟基自由基 或甲醇自由基等活性分子， 诱导寡核苷酸磷酸骨 架的断裂， 产生长度不同的碎片进入质谱进行检 测。 通过对碎片离子的分析， 即可推测获得寡核 苷酸序列。 本发 明方法对寡核苷 酸的测序具有快 速高通量、 谱 图解析简单、 碎片信号强度高的特 点， 无需与其他外置设备耦合 或进行串联质谱分 析。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 115491410 A 2022.12.20 CN 115491410 A 1.TiO2/ZnAl‑LDO纳米材 料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用。 2.根据权利要求1所述的应用， 其特 征在于， 所述寡核苷酸长度在2 ‑30nt。 3.根据权利要求1所述的应用， 其特 征在于， 具体包括： 1)、 基质制备： 制备TiO2/ZnAl‑LDO纳米材 料， 通过溶解基质的溶剂配制TiO2/ZnAl‑LDO纳米材 料溶液； 2)、 样品制备： 配制待测寡核苷酸的水 溶液； 3)、 靶板点样： 分别取等体积的待测寡核苷酸溶液和T iO2/ZnAl‑LDO纳米材料基质溶液， 采用薄层法进 行点样和干燥， 获得点样后的靶板； 4)、 点样后的靶板送入MALDI质谱仪， 进行MALDI质谱分析。 4.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤1)中， 制备Ti O2/ZnAl‑LDO纳米材料， 具 体包括： 1.1)将Zn(NO3)2·6H2O和Al(NO3)3·9H2O溶解在水中， 超声 使其充分溶解并记为A液； 1.2)将Na2MoO4·2H2O和NaOH溶于水中超声并作为B液； 1.3)将A液和B液分别放入两个滴漏斗中， 然后将其滴入20～ 30℃的包含Ti O2的水中， 同 时控制滴速， 使溶液的pH为8.5～9.5， 滴完后， 继续在20～30℃下搅拌20～40min， 并于搅拌 晶化， 离心， 洗涤至中性， 干燥， 并在 350～450℃马弗炉中煅烧2～4h， 得到TiO2/ZnAl‑LDO纳 米材料。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于， 步骤1.3)中， 6 0～70℃搅拌晶化10～14h 。 6.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤1)中， 所述的溶解基质的溶剂为甲醇、 水或甲醇与水的混合溶剂。 7.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤3)中， 采用薄层 法进行点样和干燥， 具 体包括： 将TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料基质溶液滴加到金属靶片上， 待风干后， 再滴加 待测寡核苷 酸溶液， 继续风干后， 获得点样后的靶板 。 8.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤3)中， 所述的TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料 基质溶液中TiO2/ZnAl‑LDO纳米材 料的浓度为0.5 ‑10mg/mL； 所述的待测寡核苷酸溶 液中寡核苷酸浓度为0.5 ‑10nmol/ μL。 9.根据权利 要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤4)中， 所述的MALDI质谱分析采用的离 子源检测模式为负离 子模式。 10.根据权利要求3所述的应用， 其特征在于， 步骤4)中， 所述的MALDI质谱分析采用的 离子检测器 检测模式为反射模式或线性模式。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115491410 A 2二氧化钛/锌铝水滑石类氧化物纳米材料在寡核 苷酸测序中 的应用 技术领域 [0001]本发明涉及寡核苷酸生化分析领域， 具体涉及TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料作为MALDI 基质对寡核苷酸测序中的应用。 背景技术 [0002]寡核苷酸是指由2 ‑30个核苷酸以磷酸二酯键连接而成的多核苷酸片段， 其在生物 遗传信息的存储、 处理和表达中起着至关重要的作用。 生物内源性的寡核苷酸如miRNA， 与 植物动物的生长、 器官的发育， 细胞的凋亡和增殖有关， 还可调节造血干细胞的分化， 调节 癌基因和抑癌基因的表达。 外源性的寡核苷 酸如反义寡核苷酸可作为药物分子转 染mRNA使 目标基因沉默。 此外， 具有一定空间结构的核酸适配体作为寡核苷酸的一种， 可与目标靶分 子形成类似抗原 ‑抗体的复合物， 继而广泛用于细胞成像、 新药研发、 与微生物检测等领域。 因此， 尽管寡核苷 酸仅由4种核糖核酸构成， 但 不同排列组合所构成的丰富的一级序列信息 使其具有完全不同的功能。 [0003]目前寡核苷酸序列的确定主要包括间接法和直接法两种， 间接法主要是先将寡核 苷酸反转录为相应的cDNA， 然后用现有的DNA测序方法来对其cDNA序列进行测定并且最终 推测出其原始序列， 间接法通量较高但一定程度上存在反转录错配的可能性。 直接法测序 主要依靠RNA酶在RNA特定位点剪切或终止延伸， 从而识别该位点核苷 酸类型以达到测序的 目的， 直接法测序过程复杂且通量较低因此缺 乏广普性。 质谱技术从不同核苷酸质荷比不 同的角度出发对寡核苷酸进行测序， 通过质谱解离技术使寡核苷酸碎裂产生不同断裂位点 的片段， 根据片段质荷比信息倒推序列信息， 其得到的序列信息更丰富， 准确度更高， 通量 更大。 [0004]关于利用质谱解离技术对寡核苷酸序列进行测定在早期的一些研究报道中大多 采用碰撞诱导解离(Collision  Induced Dissociation， CID)和高能碰撞解离(Higher   Collisional  Dissociation， HCD)技术。 上述解离技术由于二次解离所产生的碎片类型及 噪音信号较多使得谱图复杂， 且 大多数碎片峰信号较低， 对碎片峰的归属造成难度。 近年来 与红外激光发射器耦合的红外多 光子解离技术(Infra ‑Red Multi‑Photon Dissociation， IRMPD)或与紫外激光发射器耦合的紫外激光解离技术(Ulta ‑Violet Photon  Dissociation， UVPD)使 得待测寡核苷 酸首先吸收能量处于高能状态再进行解离， 能够提供 较高的序列 覆盖度， 但也存在碱基部分二次丢失的问题， 使得修饰位点无法得知， 且由于需 要与激光器耦合对实验条件的要求较高。 发明内容 [0005]本发明针对现行的寡核苷酸测序技术的技术问题， 克服上述背景技术中提到的不 足和缺陷， 提供TiO2/ZnAl‑LDO纳米材料作为MALDI基质对寡核苷酸测序中的应用， 具体为 一种快速、 高通量， 谱图简单易解析且不与其他设备耦合的直接质谱测序方法。 利用TiO2/说　明　书 1/7 页 3 CN 115491410 A 3