(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211246266.5 (22)申请日 2022.10.12 (71)申请人 西北大学 地址 710069 陕西省西安市太白北路2 29号 (72)发明人 段志广　郭梦迪　李娜　朱晨辉　 (74)专利代理 机构 西安启诚专利知识产权代理 事务所(普通 合伙) 61240 专利代理师 冯亮 (51)Int.Cl. G01N 21/64(2006.01) G01N 21/33(2006.01) G01N 1/28(2006.01) (54)发明名称 一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方 法 (57)摘要 本发明公开了一种用京尼平超灵敏测定蛋 白质浓度的方法， 该方法采用天然产物京尼平作 为试剂， 将梯度稀释后的蛋白标准样品分别与京 尼平试剂溶液混合， 孵育后用分光光度计检测吸 光度， 制作蛋白质浓度与 吸光度的标准曲线； 将 待测定的未知浓度蛋白样品溶液与京尼平试剂 溶液混合， 孵育后用分光光度计检测吸光度， 根 据制作的标准曲线确定样品溶液中蛋白质的浓 度。 该方法灵敏度高， 实验重复性好， 蛋白浓度测 定范围更大， 最小可精确到1.0μg/mL， 且不受到 蛋白氨基酸组成的影响， 去除了蛋白样品溶液中 存在的各种干 扰试剂。 权利要求书1页 说明书4页 附图3页 CN 115524317 A 2022.12.27 CN 115524317 A 1.一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： 步骤一、 用酒精溶 液制备京尼平试剂溶 液； 步骤二、 采用缓冲溶液梯度稀释蛋白标准样品， 将梯度稀释后的蛋白标准样品分别与 步骤一中制备 的京尼平试剂溶液混合， 孵育后用分光光度计检测吸光度， 制作蛋白质浓度 与吸光度的标准曲线； 步骤三、 采用缓冲溶液制备待测定的未知浓度蛋白样品溶液， 然后将待测定的未知浓 度蛋白样品溶液与步骤一中制备的京尼平试剂溶液混合， 孵育后用分光光度计检测吸光 度， 根据步骤二中制作的标准曲线确定样品溶 液中蛋白质的浓度。 2.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤一中所述酒精溶 液的质量浓度为5 0％。 3.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述孵 育的温度均为5 5℃～100℃， 孵育的时间均为0.5 h～16h。 4.根据权利要求3所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述孵 育的温度均为80℃～10 0℃， 孵育的时间均为2h～16 h。 5.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述缓冲溶 液的pH值均为5～ 9。 6.根据权利要求5所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述缓冲溶 液的pH值均为7～8。 7.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述分光 光度计的检测波长为570nm～6 30nm。 8.根据权利要求1所述的一种用京尼平超灵敏测定 蛋白质浓度的方法， 其特征在于， 步 骤二和步骤三中所述分光 光度计的检测波长为590nm。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115524317 A 2一种用京尼平超灵敏测定蛋白质浓度的方 法 技术领域 [0001]本发明属于生物技术的应用技术领域， 具体涉及 一种用京尼平超灵敏测定蛋白质 浓度的方法。 背景技术 [0002]蛋白浓度测定是蛋白生物技术(包括生物制 药中蛋白药物)实验中一项基本实验 内容， 它是进行SDS ‑PAGE电泳、 Western  Blot、 Eli sa、 蛋白酶活性测定、 蛋白二维电泳、 蛋白 质谱、 蛋白分子量测定、 蛋白测序等 实验的基本前提， 比较常见的为蛋白浓度测定方法包括 Lowry法， Bradford法， BCA法， UV法等。 [0003]Lowry开发了碱性铜处理后用 福林酚试剂测量蛋白质的方法。 蛋白质在碱性溶液 中其肽键与Cu2+螯合， 形成蛋白质一铜复合物， 此复合物使酚试剂的磷钼酸还原， 产生蓝色 化合物， 在一定条件下， 利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准 曲线并测定样品中 蛋白质的浓度。 Lowry分析法灵敏度高， 易于应用于微孔板， 但 耗时长， 易受多种干扰化合物 的影响。 Bradford分析法是一种经典方法， 考马斯亮蓝G ‑250染料选择性结合精氨 酸和芳香 残基， 最大光吸收由465nm变成595nm， 通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白 质的量。 在一定的蛋白浓度范围内， 蛋白浓度与吸收值呈线性增长。 Bradford分析法灵敏度 远高于Lowry法， 但由于各种蛋白质中的精氨 酸和芳香族氨基酸的含量不同， 因此Bradford 法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差， 且仍有一些物质干扰此方法的测定。 BCA (Bicinchoninic  acid)分析具有很高的灵敏度， 但成本高、 难度大且涉及大量试剂。 此外， BCA分析需要大约10分钟的吸收时间才 能得到可靠的结果。 紫外线(UV)吸收是最常用的方 法。 其优点为该方法简单、 廉价、 样品可回收且快速， 但被认为是灵敏度最低的方法。 此外， 它很容易受到缓冲成分和核酸的干扰。 [0004]以上四种测量方法仍能够测量蛋白蛋白浓度， 但仍然存在以下问题， 操作仍然不 够简单， 测量过程 不够迅速， 测量结果 不够敏感， 操作过程 不够安全。 发明内容 [0005]本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足， 提供一种用京尼平 超灵敏测定蛋白质浓度的方法。 该方法采用天然产物京尼平作为试剂， 相较于现有测定试 剂， 毒性更小。 京尼平为无色物质， 是从栀子体内组织中提取的栀子苷， 可以自发地与蛋白 质、 胶原、 明胶、 壳聚糖发生交联， 且京尼平和蛋白的交联样品具有很强的荧光特性， 与蛋白 结合产生的荧光灵敏度更高， 实验重复性更好， 蛋白浓度测定范围更大， 最小 可精确到1.0 μ g/mL， 且不受到蛋白氨基酸组成的影响， 去除了蛋白样品溶 液中存在的各种干扰试剂。 [0006]为解决上述技术问题， 本发明采用的技术方案是： 一种用京尼平超灵敏测定蛋白 质浓度的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： [0007]步骤一、 用酒精溶 液制备京尼平试剂溶 液； [0008]步骤二、 采用缓冲溶液梯度稀释蛋白标准样品， 将梯度稀释后的蛋白标准样品分说　明　书 1/4 页 3 CN 115524317 A 3