(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211111494.1 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 苏州大学 地址 215000 江苏省苏州市相城区济学路8 号 (72)发明人 郝世鹏　徐惠中　徐廷昊　李耘成　 邢家宁　强磊　王梓硕　吴朝欢　 戴佳文　彭岩　孙启萌　 (74)专利代理 机构 苏州见山知识产权代理事务 所(特殊普通 合伙) 32421 专利代理师 袁丽花 (51)Int.Cl. G01N 1/28(2006.01) G01N 1/30(2006.01) G01N 1/36(2006.01)G01N 1/44(2006.01) G01N 1/06(2006.01) G01N 21/64(2006.01) (54)发明名称 一种用于生物组织无限制多轮循环膨胀的 浸泡液及方法 (57)摘要 本发明公开了一种用于生物组织无限制多 轮循环膨胀的浸泡液及方法， 特点是该浸泡液为 质量浓度2 0％丙烯酰胺， 3％多聚甲醛和0.1 ％偶 氮二(2氨基丙脒)盐酸盐， 余量为水的水凝胶溶 液， 其用于生物组织无限制多轮循环膨胀的方 法， 包括以下步骤： 1)将生物组织室温浸泡于浸 泡液中振荡 1‑24小时； 2)将 浸泡过的生物组织取 出， 置于密闭玻璃管中80℃放置2小时， 使 位于生 物组织内部的浸泡液在组织内聚合成胶； 3)将成 胶后的生物组织放入蛋白质变性溶液中80℃放 置2×n个小时； 4)将多轮膨胀后的组织切片， 采 用染色液对组织切片进行共价键荧光染色， 优点 是能实现对组织的多轮包埋和膨胀， 对较为坚硬 的组织也能实现较大的放大倍数。 权利要求书1页 说明书7页 附图10页 CN 115452513 A 2022.12.09 CN 115452513 A 1.一种用于生物组织无限制多轮循环膨胀的浸泡液， 其特征在于： 所述的浸泡液为质 量浓度为20％丙烯酰胺， 3％多聚甲醛和0.1％偶氮 二(2氨基丙 脒)盐酸盐， 余量为水的水凝 胶溶液。 2.一种用于生物组织无限制多轮 循环膨胀的方法， 其特 征在于包括以下步骤： (1)浸泡液浸泡： 将生物组织室温浸泡于浸泡液中振荡16 ‑24小时， 浸泡液配方为质量 浓度为20％丙烯酰胺， 3％多聚甲醛和0.1％V50， 其中丙烯酰胺为聚合物的单体， 多聚甲醛 为交联剂， V5 0为聚合反应的引发剂； (2)聚合成胶： 将步骤(1)浸泡过的生物组织取出， 置于密闭玻璃管中80℃放置2小时， 使吸附于生物组织内部的浸泡液在组织内聚合成胶； (3)高温变性： 将成胶后的生物组织放入蛋白质变性溶液中80℃放置2 ×n个小时， 即完 成生物组织 膨胀， 其中n 为膨胀轮数， 取值 通常为5‑10； (4)共价键染色： 将多轮膨胀后的组织切片， 采用染色液对组织切片进行共价键荧光染 色。 3.根据权利要求2所述的一种用于生物组织无限制多轮循环膨胀的方法， 其特征在于 步骤(3)中所述的蛋白质变性溶液配方为： 50mM三羟甲基氨基甲烷， 200mM十二烷基硫酸钠， 200mM氯化钠， 溶剂为水， pH为9.0 。 4.根据权利要求2所述的一种用于生物组织无限制多轮循环膨胀的方法， 其特征在于 步骤(4)中所述的染色液配方为： 1mM罗丹明NHS酯， 100mM碳酸钠， 70mM十二烷基硫酸钠， 0.2％Trito n X‑100， 溶剂为水， pH为1 1.6。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115452513 A 2一种用于生物组织无限制多轮循环膨 胀的浸泡液及方 法 技术领域 [0001]本发明涉及 一种生物组织膨胀的浸泡液， 尤其是涉及一种用于生物组织无限制多 轮循环膨胀的浸泡液及方法。 背景技术 [0002]自2015年来， 膨胀显微技术(Expansion  Microscopy， 简称ExM)作为一种新型的超 分辨成像技术， 凭借其不依赖昂贵光学仪器的优势越来越受到科研人员的关注。 膨胀显微 技术将生物样品锚定在可膨胀的水凝胶 网格中， 通过水凝胶在低离子强度溶液中的膨胀， 达到将样品内结构细节放大， 从而在普通 光学显微镜下即可实现超分辨成像。 [0003]现有的膨胀方法常使用丙烯酰胺、 丙烯酸钠为单体， 甲叉双丙烯酰胺为 交联剂， 对 生物样品进行水凝胶包埋和膨胀。 运用此水凝胶配方对生物样品膨胀所得膨胀倍数通常为 4倍， 从而使传统光学成像分辨率从200nm提升至50nm左右[Chen  F,Tillberg  PW&Boyden   ES(2015)Optical  imaging.Expansion  microscopy.Science  347,543‑548]。 最近pan ‑ExM 方法对细胞样品进行了二轮包埋和膨胀， 使膨胀倍数达到了13 ‑21倍[M'Saad  O& Bewersdorf  J(2020)Light  microscopy  of proteins  in their ultrastructural   context.Nat  Commun 11(1):3850]。 通过对膨胀后的细胞样品进行共价键染色， 此方法对 诸多细胞器(如线粒体、 核孔、 核仁等)内部的结构都能清晰地 成像。 但是， 现有的pan ‑ExM膨 胀技术主要有三方面缺陷。 一是其所需水凝胶化学配方较为复杂， 为了对前轮的交联剂进 行溶解， 每轮水凝胶包埋所用水凝胶配方各不相同。 二是该方法对较为坚硬的组织(如肾 脏、 心脏等)， 难以实现较大膨胀倍数(≥8)。 三是该方法膨胀造成的组织形态畸变较大， 影 响对组织超微结构成像的准确性。 发明内容 [0004]本发明所要解决的技术问题是提供一种能实现对组织的多轮包埋和膨胀， 对较为 坚硬的组织也能实现较大的放大倍数的用于生物组织无限制多轮循环膨胀的浸泡液及方 法。 [0005]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 一种用于生物组织无限制多轮循 环膨胀(Cyclic  Expansion  Microscop y， 简称Cyc ‑ExM)的浸泡液， 所述的浸泡液为质量浓 度20％丙烯酰胺， 3％多聚甲醛和0.1％偶氮二(2氨基丙脒)盐酸盐(V50)， 余量为水的水凝 胶溶液。 [0006]一种用于生物组织无限制多轮 循环膨胀的方法， 包括以下步骤： [0007](1)浸泡液浸泡： 将生物组织室温浸泡于浸泡液中振荡1 ‑24小时(时间由组织大小 而定)， 浸泡液配方为质量浓度为20％丙烯 酰胺， 3％多聚甲醛和0.1％V50， 其中丙烯 酰胺为 聚合物的单体， 多聚甲醛为交联剂， V5 0为聚合反应的引发剂； [0008](2)聚合成胶： 将 步骤(1)浸泡过的生物组织取出， 置于密闭玻璃 管中80℃放置2小 时， 使位于生物组织内部的浸泡液在组织内聚合成胶；说　明　书 1/7 页 3 CN 115452513 A 3